三种石首鱼紧密连锁的α-和β-珠蛋白基因的克隆及其顺式调控元件的分析

论文摘要

高等脊椎动物和大多数硬骨鱼类血红蛋白是红细胞中的主要蛋白质，每个血红蛋白分子由四个亚单位构成，每一个单位由一条珠蛋白肽链和一个血红素辅基组成，即血红蛋白分子是由二对珠蛋白链构成的球形四聚体。作为最原始的脊椎动物，鱼类是研究血红蛋白多样性和进化的重要模型。石首鱼是分布范围广泛，世界范围内共有70属300余种。中国有13属37种，居世界首位。大黄鱼、美国红鱼、（魚免）状黄姑鱼是我国沿海重要养殖的石首鱼类，但其分子生物学领域研究还处于起步阶段，本研究对它们的珠蛋白基因的结构和顺式调控元件进行了初步研究，为更深入研究石首鱼类珠蛋白基因簇的结构、进化和调控方式提供理论基础。根据真鲷、黄尾鲱鱼和其他脊椎动物α-和β-珠蛋白基因cDNA序列设计兼并性引物，采用3′末端快速扩增法（3′-RACE），以大黄鱼脾脏cDNA为模板，首次扩增到大黄鱼α-和β1-珠蛋白基因cDNA编码区及3′-端非编码区序列；根据大黄鱼、黄尾鲱鱼和其他脊椎动物α-和β-珠蛋白基因cDNA序列设计兼并性引物，采用RT-PCR，以美国红鱼脾脏cDNA为模板，扩增到美国红鱼α-和β1-珠蛋白cDNA编码区。与人珠蛋白氨基酸序列相比，大黄鱼和美国红鱼珠蛋白链有三个重要的功能性氨基酸残基发生了改变：α39 Thr→Gln，α113 His→Tyr和β117 His→Lys。根据克隆到的大黄鱼、美国红鱼α-和β-珠蛋白基因cDNA两端序列设计特异性引物，以其肝脏基因组DNA为模板，克隆到大黄鱼α-珠蛋白基因、美国红鱼α-珠蛋白基因、大黄鱼β2-珠蛋白基因、美国红鱼β1-和β2-珠蛋白基因。大黄鱼和美国红鱼珠蛋白基因都具有典型的脊椎动物珠蛋白基因结构，由3个外显子组成，中间间隔着两个内含子。内含子插入位置也与其他脊椎动物珠蛋白基因一致，内含子5′和3′端的特异性剪切位点是典型的GT-AG序列。链接分析表明大黄鱼α-和β2-珠蛋白基因以头对头（5′对5′）方式紧密连锁在一起，两基因间序列仅有391bp，是目前报道的最短的鱼类珠蛋白基因间序列。美国红鱼α-和B1-珠蛋白基因也是以5′对5′方式链接的。鱼类紧密连锁的α-和β-珠蛋白基因以及它们之间的基因间序列构成一个珠蛋白基因复合体。根据已克隆到的珠蛋白基因及基因间序列设计两对特异性引物，用两步PCR克隆了大黄鱼、美国红鱼、（魚免）状黄姑鱼珠蛋白基因复合体完整序列并对其序列进行了分析与比较，结果发现三个复合体序列同源性很高，在复合体中三个α-珠蛋白基因第二外显子都有GGG（A）碱基插入，笔者认为这是石首鱼珠蛋白基因复合体序列的共同特征之一；α-珠蛋白基因第二内含子序列不仅种间差别很大，而且从不同地点采集的大黄鱼α-珠蛋白基因第二内含子大小也不一样，因此α-珠蛋白基因第二内含子可能是复合体中的高变区；在β-珠蛋白基因第一内含子中都存在TATA、CACCC、GATA三个保守基序；三个复合体珠蛋白基因间序列长度都小于430bp，而且保守的启动子元件出现的位置也相似；美国红鱼珠蛋白基因间序列β-珠蛋白基因启动子区域存在两个位置十分接近CCAAT框，但大黄鱼和（魚免）状黄姑鱼珠蛋白基因间序列相应区域因为存在部分序列缺失或单个碱基突变只有一个CCAAT框。将大黄鱼紧密连锁的α-和β2-珠蛋白基因间序列插入已切去CMV的报告基因表达载体pEGFP-4.1中，然后将构建的真核表达载体转染Vero细胞，结果表明此序列能够驱动增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达，具有启动子功能。为比较三种石首鱼紧密连锁的α-和β-珠蛋白基因间序列启动子活性强弱，将三个珠蛋白基因间序列分别克隆至报告基因表达载体pGL3-Basic中，然后将构建的真核表达载体转染Vero细胞，通过检测相对荧光素酶活力，结果证实三种石首鱼紧密连锁的α-和β-珠蛋白基因间序列启动子活性无显著性差异。虽然大黄鱼珠蛋白基因间序列能指导EGFP和荧光素酶在Vero细胞中表达，但Vero细胞毕竟是哺乳动物细胞，以它为研究对象获得的试验结果与在鱼类生理条件下珠蛋白表达调控规律是否一致还不确定。笔者初步建立了一套重组质粒转染原代培养的鲫鱼红细胞的体系。为了证实这套体系的可操作性和大黄鱼β2-珠蛋白基因内含子1是否具有调控功能，将大黄鱼珠蛋白基因复合体的多个区段分别克隆至报告基因表达载体pGL3-Basic中，然后将构建的真核表达载体转染鲫鱼红细胞，通过检测相对荧光素酶活力，结果证实大黄鱼珠蛋白基因间序列能指导荧光素酶在鲫鱼红细胞中表达，而且大黄鱼β-珠蛋白基因内含子1在调控大黄鱼珠蛋白基因表达时起正调控作用。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第一部分文献综述

第一章人类血红蛋白的结构和功能简介

1 正常人类血红蛋白的种类

2 人类血红蛋白的分子结构

2.1 珠蛋白链的一级结构

2.2 珠蛋白链的空间结构

2.3 珠蛋白链与血红素的结合

2.4 血红蛋白的四级结构

3 影响血红蛋白功能的效应物

3.1 质子

3.2 氨甲酰基加合体

3.3 二磷酸甘油酸

第二章人类珠蛋白基因结构及其表达调控

1 珠蛋白基因簇的结构特点

2 珠蛋白基因簇的基因表达调控

2.1 基因座控制区

2.2 顺式作用元件

2.3 转录调控因子

2.4 珠蛋白基因表达调控研究的模型

第三章鱼类血红蛋白研究进展

1 无Hb的南极冰鱼

2 只表达1条珠蛋白链的七鳃鳗

3 黄尾平口石首鱼和蓝鳍金枪鱼具Root效应的Hb

3.1 黄尾平口石首鱼具Root效应的Hb

3.2 蓝鳍金枪鱼具Root效应的Hb

4 鳗鲡目阴性和阳性Hb

5 虹鳟鱼HbⅠ—Ⅳ

5.1 虹鳟鱼HbⅠ

5.2 虹鳟鱼Hb的多样性

第四章鱼类珠蛋白基因研究进展

1 鲤形目的鲤鱼与斑马鱼

1.1 鲤鱼

1.2 斑马鱼

2 红鳍东方豚

3 青鳉

4 南极鱼类

第二部分研究内容

第五章大黄鱼α-和β-珠蛋白基因的克隆及其链接方式的初步分析

1 材料

1.1 实验鱼

1.2 菌株和质粒

1.3 工具酶与试剂

2 方法

2.1 引物设计

2.2 大黄鱼脾脏总RNA的提取

2.3 反转录

1-珠蛋白基因cDNA部分序列的克隆'>2.4 大黄鱼β₁-珠蛋白基因cDNA部分序列的克隆

2.5 3′-RACE PCR

2.6 珠蛋白基因cDNA的T-A克隆

2.7 大黄鱼肝脏基因组提取

2.8 α-和β-珠蛋白基因的扩增

2.9 α-和β-珠蛋白基因链接分析

2.10 序列测定及分析

3 结果

1-珠蛋白基因cDNA核苷酸和推导的氨基酸序列'>3.1 β₁-珠蛋白基因cDNA核苷酸和推导的氨基酸序列

3.2 α-珠蛋白基因cDNA核苷酸和推导的氨基酸序列

2-珠蛋白基因核苷酸序列'>3.3 大黄鱼α-和β₂-珠蛋白基因核苷酸序列

3.4 大黄鱼α-和β-珠蛋白基因的链接方向

4 讨论

1-珠蛋白的特点'>4.1 大黄鱼α-和β₁-珠蛋白的特点

4.2 大黄鱼珠蛋白基因的多态性

4.3 大黄鱼α-和β-珠蛋白基因的链接分析

第六章美国红鱼珠蛋白链的分离及其α-和β-珠蛋白基因的克隆

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 质粒、菌株和生化试剂

1.3 常用缓冲液及培养基试剂配制

2 方法

2.1 血红蛋白的提取

2.2 珠蛋白链的分离

2.3 总RNA的提取与反转录

2.4 扩增美国红鱼α-和β-珠蛋白基因cDNA

2.5 美国红鱼肝脏基因组提取

2.6 扩增美国红鱼β-珠蛋白基因

2.7 紧密链锁的α-和β-珠蛋白基因间序列的扩增

2.8 PCR产物序列测定

2.9 测序结果分析和与其它物种序列的比较

3 结果

3.1 珠蛋白链分离

3.2 α-珠蛋白基因cDNA核菅酸和推导的氨基酸序列分析

1-珠蛋白基因cDNA核苷酸和推导的氨基酸序列'>3.3 β₁-珠蛋白基因cDNA核苷酸和推导的氨基酸序列

3.4 β-珠蛋白基因核苷酸序列

3.5 紧密链锁的α-和β-珠蛋白基因间序列

4 讨论

4.1 美国红鱼珠蛋白肽链的分离

4.2 美国红鱼和大黄鱼珠蛋白氨基酸序列比较分析

1-和β₂-珠蛋白基因核苷酸序列比较分析'>4.3 美国红鱼β₁-和β₂-珠蛋白基因核苷酸序列比较分析

4.4 紧密链接的α-和β-珠蛋白基因间序列分析

第七章三种石首鱼珠蛋白基因复合体序列比较及大黄鱼基因间序列调控功能的初步鉴定

1 材料

1.1 实验材料

1.2 菌株和质粒

1.3 工具酶与试剂

2 方法

2.1 肌肉基因组提取

2.2 珠蛋白基因复合体的扩增

2.3 表达载体pInter/EGFP的构建

2.4 转染级超纯度真核表达质粒的制备

2.5 脂质体介导质粒转染Vero细胞

2.6 PCR产物序列测定

2.7 测序结果分析和与其它物种序列的比较

3 结果

3.1 大黄鱼、美国红鱼、鮸状黄姑鱼珠蛋白基因复合体序列

3.2 报告基因载体pInter/EGFP的构建

3.3 荧光检测

4 讨论

4.1 石首鱼珠蛋白基因复合体序列的特点

2-珠蛋白基因间序列启动子功能的初步鉴定'>4.2 大黄鱼紧密连锁的α-和β₂-珠蛋白基因间序列启动子功能的初步鉴定

2-珠蛋白基因内含子1的调控功能鉴定'>第八章三种石首鱼珠蛋白基因复合体基因间序列启动子活性比较和大黄鱼B₂-珠蛋白基因内含子1的调控功能鉴定

1 材料

1.1 实验鱼

1.2 菌株和质粒

1.3 工具酶与试剂

1.4 主要仪器

2 方法

2.1 表达载体pCroaker,pCuneate和pRedrum的构建

2.2 表达载体pIntergene的构建

2.3 表达载体pIntronInter的构建

2.4 表达载体pInterIntron的构建

2.5 转染级超纯度真核表达质粒的制备

2.6 鲫鱼红细胞的提取

2.7 脂质体介导重组质粒转染鲫鱼红细胞

2.8 荧光素酶活性测定法

3 结果

3.1 真核表达载体pCroaker,pCuneate和pRedrum的构建及鉴定

3.2 重组载体转染Vero细胞后荧光素酶的相对活性分析

3.3 真核表达载体pIntergene的构建及鉴定

3.4 真核表达载体pIntronInter的构建及鉴定

3.5 真核表达载体pInterIntron的构建及鉴定

3.6 重组载体转染红细胞后荧光素酶的相对活性分析

4 讨论

4.1 三种石首鱼紧密连锁的α-和β-珠蛋白基因间序列启动子活性强弱比较

2-珠蛋白基因内含子1调控活性分析'>4.2 大黄鱼β₂-珠蛋白基因内含子1调控活性分析

第三部分总结与展望

1 结论与主要创新点

2 不足与展望

参考文献

第四部分附录

附录1 常用试剂及缓冲液

附录2 攻读博士学位期间发表和录用的学术论文

致谢

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