6种水产养殖鱼类常见弧菌抗原芯片检测技术的建立

论文摘要

近年来我国水产养殖业飞速发展，养殖的水产动物种类日益增多，随着集约化养殖形式和养殖密度不断扩大，病原、宿主与环境之间的相互作用导致水产动物的抵抗力降低，发病日趋频繁。细菌性疾病是水产动物最常见的一类疾病，是目前水产养殖鱼类的主要病害，其中以弧菌病流行最为广泛。弧菌广泛分布于海洋环境中，可以感染多种水产养殖鱼类并造成严重死亡，给水产养殖业造成巨大的经济损失。抗原芯片的基本原理是将抗原固定在芯片载体上制备成检测芯片，检测血清中相对应的抗体，近些年已被广泛应用于临床学和流行病学。抗原芯片因其具有高灵敏性、高特异性、高通量及多样品或多指标平行分析的优点，在病原检测方面显示出广阔的应用前景。但目前将抗原芯片应用于水产动物细菌性疾病检测的相关报道较少，因此本文将抗原芯片技术与水产动物免疫学原理相结合，选取鱼肠道弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌、哈维氏弧菌6种水产养殖鱼类常见弧菌为研究对象，构建水产养殖鱼类常见弧菌的抗原芯片，并进行实际应用，证明构建的抗原芯片可以应用于水产养殖鱼类6种常见弧菌性疾病的准确诊断。具体结果如下：（1）在确认各弧菌菌株致病性的基础上，提取各弧菌的外膜蛋白、胞外产物、鞭毛蛋白等抗原组分以及全菌超声波破碎液，考马斯亮蓝法测定各抗原组分浓度，以HRP标记牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体，进行了病原性确认。结果显示，提取的各弧菌抗原组分均可与对应的牙鲆抗血清发生反应，说明其病原性良好，可以用来构建抗原芯片。（2）采用灭活全菌注射健康牙鲆，获取各弧菌的牙鲆抗血清；ELISA检测牙鲆抗血清的效价变化并分析各抗原组分与牙鲆抗血清的交叉反应情况。结果显示，牙鲆的抗体水平不断上升，在第4、5、6周达到最高，由此选取4-6周的抗血清用于后续抗原芯片的检测。各弧菌的牙鲆抗血清均与对应弧菌的反应程度最强烈，与其他种类的弧菌存在程度不等的交叉反应，而胞外产物和鞭毛蛋白的交叉反应很小，确认了抗原芯片构建的可行性。（3）采用前期优化的芯片载体、点样缓冲液、固定时间、封闭时间、抗体孵育时间及清洗缓冲液；将同一弧菌的多种抗原组分点样于芯片载体组成一个矩阵，构建6种弧菌抗原芯片，并对牙鲆抗血清进行检测。结果显示，牙鲆抗血清与对应弧菌的各矩阵点全部显色，与其他弧菌的矩阵点无显色反应或部分显色，说明构建的抗原芯片可以用于水产养殖动物常见的6种致病性弧菌的准确检测。（4）将制备的抗原芯片应用于人工感染牙鲆和自然发病大菱鲆的疾病检测。结果显示，人工感染的牙鲆抗血清与抗原芯片上鳗弧菌的各抗原矩阵点反应完全，自然发病的大菱鲆抗血清与抗原芯片上溶藻弧菌的各抗原矩阵点反应完全，说明牙鲆为鳗弧菌感染，大菱鲆为溶藻弧菌感染。同时采用ELISA检测得到了相同的结果。表明制备的弧菌抗原芯片可以应用于弧菌病的实际检测。抗原芯片是一种重要的免疫芯片，是对传统免疫学检测手段的发展。本文构建的抗原芯片可以用于水产养殖鱼类的6种弧菌性疾病的有效检测，为水产养殖动物弧菌病的高通量检测技术的发展提供了技术和实践基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 鱼类常见弧菌性疾病概述
• 1.2 弧菌性疾病检测技术进展
• 1.3 弧菌主要抗原组分
• 1.4 抗原芯片技术概况
• 1.5 本论文的研究目的、意义及创新之处
• 2 弧菌抗原芯片检测技术的建立
• 2.1 弧菌致病性实验
• 2.2 6种弧菌主要抗原组分的制备
• 2.3 牙鲆抗 6 种弧菌血清的制备
• 2.4 牙鲆抗血清与各弧菌及抗原组分间的交叉反应分析
• 2.5 抗原芯片的构建及检测
• 3 6种弧菌抗原芯片的应用
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论
• 结语
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文