论文摘要
近年来,肿瘤发生的机制已经成为国内外学者关注的焦点,而从分子生物学角度阐述肿瘤发生、发展等越来越受到重视。在我国,神经胶质瘤是神经系统的第一大肿瘤,具有发病率高、进展快、预后差等特点,而且目前发病有上升趋势。作为RNA结合蛋白质CELF家族的一员,CUGBP1在细胞核内通过刺激非连续外显子的保留或删除而调节一些mRNA前体的选择性剪接;在细胞质中,通过结合到靶向mRNA的特定序列而调节一些mRNA的翻译或降解;还可通过RNA编辑酶而调节一些mRNA的编辑。CUGBP1不仅在胚胎及心脏发育、骨骼肌及脂肪组织分化、生殖细胞形成等方面具有重要的影响,而且在肝脏细胞及乳腺上皮细胞增殖甚至肿瘤形成以及一些肿瘤的恶化中发挥作用。但其在人胶质瘤细胞中是否异常表达以及改变这种表达后对胶质瘤有何影响,国内外尚未见相关报道。研究意义旨在分析CUGBP1在胶质瘤细胞中的表达水平,明确其与人胶质瘤的关系;同时,从细胞增殖、细胞凋亡的现象及相关基因的变化解释CUGBP1与胶质瘤发生、发展的关系。研究目的通过CUGBP1在不同胶质瘤细胞株、胶质瘤脑组织以及正常脑组织中的表达检测和观察CUGBP1基因敲减后细胞增殖、细胞凋亡变化以及相关基因表达改变,分析CUGBP1与胶质瘤发生的相关性,以阐明CUGBP1在胶质瘤发生、发展中的作用及机制。实验方法1、表达检测选择RT-PCR和实时定量RT-PCR方法从mRNA水平上观察并比较CUGBP1在不同胶质瘤细胞株、胶质瘤脑组织以及正常脑组织中的表达。半定量RT-PCR法检测CUGBP1在不同胶质瘤细胞株的表达,同时以管家基因GAPDH作为系统阳性对照。实时定量RT-PCR法检测CUGBP1在不同病理级别胶质瘤脑组织的表达水平,并以正常脑组织中的水平作为参照标准,同时以GAPDH作为系统阳性对照。2、RNA干扰慢病毒构建及其敲减效率检测为进一步探索CUGBP1与胶质瘤的相关性及其机制,构建CUGBP1-shRNA慢病毒,转染胶质瘤细胞株U251,并检测其转染及敲减效率。2.1 RNA干扰慢病毒构建设计干扰靶点序列,连接到慢病毒载体,包装成病毒颗粒。2.2细胞计数运用普通光学显微镜和荧光显微镜观察和细胞计数,评估转染效率。2.3实时定量RT-PCR法检测CUGBP1-shRNA慢病毒转染胶质瘤细胞的敲减效果。3、细胞增殖CUGBP1在某些病理情况下与肝脏及乳腺上皮细胞的增殖密切相关,是否在胶质瘤发生中也有类似现象,我们通过CUGBP1-shRNA慢病毒转染胶质瘤细胞而敲减CUGBP1表达以揭示其与细胞增殖的关系。3.1细胞计数,绘制CUGBP1-shRNA慢病毒转染组及Scr-shRNA慢病毒转染组两组细胞生长曲线,分析敲减对细胞生长的影响。3.2双抗体夹心酶标免疫分析法测定转染CUGBP1-shRNA慢病毒的人胶质瘤细胞BrdU掺入的OD值,同时以Scr-shRNA慢病毒转染细胞作为阴性对照,分析敲减对DNA合成及细胞增殖的影响。4、细胞周期分布及细胞凋亡CUGBP1在强直性肌营养不良成肌细胞中使某些与细胞周期退出相关的蛋白质如P21等表达或活性改变,进而使细胞周期退出障碍,从而发生突变或异常增生的几率增加。这种现象是否也出现在胶质瘤细胞,我们通过CUGBP1-shRNA慢病毒转染胶质瘤细胞而敲减CUGBP1表达以揭示其与细胞周期分布及细胞凋亡的关系。4.1运用FACS检测CUGBP1-shRNA慢病毒转染胶质瘤细胞后的细胞周期分布比例,同时以转染Scr-shRNA慢病毒细胞作为阴性对照,分析敲减对细胞周期分布的影响。4.2运用FACS检测CUGBP1-shRNA慢病毒转染胶质瘤细胞后的细胞凋亡比例,同时以转染Scr-shRNA慢病毒细胞作为阴性对照,分析敲减对细胞凋亡的影响5、细胞周期及细胞凋亡相关基因检测为进一步探究CUGBP1与胶质瘤细胞增殖和凋亡相关的机制,我们检测了敲减后相关基因的表达。5.1实时定量RT-PCR法检测敲减后凋亡抑制基因BCL2的表达并与阴性对照比较,分析敲减对BCL2的影响。5.2实时定量RT-PCR法检测敲减后细胞周期抑制基因CDKN1A的表达并与阴性对照比较,分析敲减对CDKN1A的影响。5.3实时定量RT-PCR法检测敲减后DNA合成相关基因PCNA的表达并与阴性对照比较,分析敲减对PCNA的影响。5.4实时定量RT-PCR法检测敲减后DNA合成相关基因MCM2-7的表达并与阴性对照比较,分析敲减对MCM2-7的影响。实验结果1、表达检测1.1以管家基因GAPDH作为参照,RT-PCR显示CUGBP1 mRNA在不同胶质瘤细胞株中均有表达。1.2以管家基因GAPDH作为内参,实时定量RT-PCR显示在人胶质瘤组织中CUGBP1 mRNA的表达量较正常脑组织明显增高（约2.96倍）,并且随着肿瘤分级的增加,其表达量有增高的趋势,胶质瘤Ⅰ级增高约2.26倍、胶质瘤Ⅲ级增高约2.36倍、胶质瘤Ⅳ级增高约4.27倍。2、敲减效率检测2.1运用普通光学显微镜和荧光显微镜观察和计数CUGBP1-shRNA慢病毒转染组及Scr-shRNA慢病毒转染组两组转染后72小时荧光阳性细胞占所有胶质瘤细胞的比例,显示均大于95%,提示高效转染。2.2以管家基因GAPDH作为内参,实时定量RT-PCR显示CUGBP1-shRNA慢病毒转染胶质瘤细胞中CUGBP1 mRNA的表达量较阴性对照组降低,最高达约92%,提示CUGBP1-shRNA慢病毒能高效转染胶质瘤细胞株,并使CUGBP基因在mRNA水平上受到明显抑制,是一种可靠的基因沉默工具。3、细胞增殖3.1以Scr-shRNA慢病毒转染细胞作为阴性对照,借助CELLOMICS对转染CUGBP1-shRNA慢病毒人胶质瘤细胞每天检测读板一次并拍照,连续5天。结果显示对照组细胞随着培养天数的增加细胞数目也逐渐增加,第5天时细胞数目增加了3倍;而CUGBP1-shRNA组的细胞数目没有明显变化,提示CUGBP1基因敲减使人胶质瘤细胞的增殖受到显著抑制。3.2以Scr-shRNA慢病毒转染细胞作为阴性对照,利用双抗体夹心酶标免疫分析法测定转染CUGBP1-shRNA慢病毒胶质瘤细胞BrdU掺入的OD值,结果显示CUGBP1-shRNA组胶质瘤细胞的ODBrdU在第一天和第三天均比阴性对照组减少,第三天的减少更显著,提示CUGBP1基因敲减抑制了DNA合成,进而抑制胶质瘤细胞的增殖能力。4、细胞周期及细胞凋亡4.1以Scr-shRNA慢病毒转染细胞作阴性对照,利用FACS对CUGBP1-shRNA慢病毒转染人胶质瘤细胞进行细胞周期检测,显示CUGBP1-shRNA转染胶质瘤细胞处于S期的细胞比例显著增加,达67.71%,而处于G0//G1期和G2/M期的细胞比例明显减少,提示CUGBP1基因敲减使胶质瘤细胞的细胞周期分布发生改变,S期细胞比例增多,表明发生S期阻滞。4.2以Scr-shRNA慢病毒转染细胞作阴性对照,利用FACS对CUGBP1-shRNA慢病毒转染人胶质瘤细胞进行细胞凋亡检测,显示CUGBP1-shRNA转染胶质瘤细胞的细胞凋亡比例与对照组比较有明显的增加,达73.8%,提示CUGBP1基因敲减使胶质瘤细胞株的细胞（早期）凋亡明显增加,表明该基因有抑制胶质瘤细胞凋亡的作用。5、细胞周期及细胞凋亡相关基因表达5.1以管家基因GAPDH作为内参,采用实时定量RT-PCR方法对CUGBP1-shRNA慢病毒感染胶质瘤细胞的BCL2 mRNA的表达进行检测,同时以Scr-shRNA慢病毒感染细胞作为阴性对照,结果显示CUGBP1-shRNA组胶质瘤细胞BCL2 mRNA的表达量较阴性对照组显著降低。提示CUGBP 1基因敲减下调了BCL2基因的表达,因而CUGBP1基因具有上调BCL2的表达进而抑制细胞凋亡,促进肿瘤细胞生长的作用。5.2以管家基因GAPDH作为内参,采用Real-time定量RT-PCR的方法对CUGBP1-shRNA慢病毒感染胶质瘤细胞CDKN1A mRNA的表达进行检测,同时以Scr-shRNA慢病毒感染细胞作为阴性对照,结果显示CUGBP1-shRNA组胶质瘤细胞CDKN1A mRNA的表达量较阴性对照组显著升高,提示CUGBP1基因敲减上调了CDKN1A基因的表达,因而CUGBP1基因具有下调CDKN1A基因的表达进而解除其对细胞周期的抑制,促进肿瘤细胞生长的作用。5.3以管家基因GAPDH作为内参,采用Real-time定量RT-PCR方法对CUGBP1-shRNA慢病毒感染胶质瘤细胞PCNA mRNA的表达进行检测,同时以Scr-shRNA慢病毒感染细胞作为阴性对照,结果显示CUGBP1-shRNA组胶质瘤细胞的PCNA mRNA表达量较阴性对照组显著降低,提示CUGBP1基因敲减下调了PCNA基因的表达,因而CUGBP1基因具有上调PCNA基因表达进而促进DNA合成、促进胶质瘤细胞生长的作用。5.4以管家基因GAPDH作为内参,采用Real-time定量RT-PCR方法对CUGBP1-shRNA慢病毒感染胶质瘤细胞MCM2-7 mRNA的表达进行检测,同时以Scr-shRNA慢病毒感染细胞作为阴性对照,结果显示CUGBP1-shRNA组胶质瘤细胞的MCM2-7 mRNA的表达量除MCM6-7轻度降低外,其它均较阴性对照组显著降低,提示CUGBP1基因敲减下调了MCM2-7基因的表达,因而CUGBP1基因具有上调MCM2-5基因表达进而促进细胞DNA合成、促进胶质瘤细胞生长的作用。结论:1、本研究首次发现CUGBP1在不同胶质瘤细胞株细胞及人胶质瘤组织中高表达,而且其表达有随胶质瘤病理分级的增加而增加的趋势。2、CUGBP1-shRNA慢病毒能够高效转染恶性胶质瘤细胞株U251细胞并稳定敲减其CUGBP1基因表达。3、CUGBP1基因敲减能够抑制恶性胶质瘤U251细胞增殖及DNA合成功能,因而抑制U251细胞的生长。4、CUGBP1基因敲减能够引起恶性胶质瘤U251细胞S期阻滞,抑制细胞周期进程;CUGBP1基因敲减还能够诱导U251细胞（早期）凋亡。5、CUGBP1基因敲减能够下调细胞凋亡抑制基因BCL2表达,上调细胞周期抑制基因CDKN1A表达,还能够下调DNA合成相关基因PCNA及MCM2-7表达。以上结论提示CUGBP1敲减可能通过抑制细胞增殖及DNA合成、抑制细胞周期进程及诱导细胞凋亡而抑制胶质瘤的发生和发展;这间接证明CUGBP1具有促进细胞增殖及DNA合成,促进细胞周期进程及抑制细胞凋亡,进而促进胶质瘤发生发展的癌基因样作用。CUGBP1可以作为恶性胶质瘤的预测指标之一并可作为恶性胶质瘤基因治疗的潜在分子靶点。