泡桐丛枝病植原体延伸因子tuf基因分析及其他寄主植物的检测

论文摘要

论文包括泡桐丛枝病植原体南阳分离物（PaWB）延伸因子（EF-TU）基因tuf的研究、泡桐丛枝病田间寄主的检测和鉴定及其他两种植物病害的植原体检测三方面研究内容。根据GenBank中已登录的植原体延伸因子tuf基因的保守核苷酸序列设计特异引物,扩增得到泡桐丛枝病植原体（PaWB）南阳分离物的tuf基因,核苷酸长度1185bp,编码394个氨基酸的完整蛋白序列,大小约为43 kDa。利用蛋白分析软件TMHMM 2. 0和PROSTⅡ预测此植原体tuf为非跨膜蛋白且定位于植原体细胞质中。将PaWB tuf基因连接到pGEX-4T-3表达载体,转化大肠杆菌BL21 （DE3）表达出分子量约62 kDa含有GST标签的融合蛋白。用该融合蛋白免疫德国大白兔获得了特异性较高的抗血清。用不同的方法对泡桐丛枝病株制备的抗原进行ELISA和Dot blotting的结果进一步显示了tuf蛋白具有与膜结合的特性,对提取抗原的冻融处理是获得理想ELISA结果的重要前提条件。Western blot和间接免疫荧光分析表明,该抗血清分别与PaWB、PeV和CWB植原体抗原产生特异免疫反应,而与相应的健康植株对照及JWB、BWB植原体抗原无免疫反应。用分子生物学的方法对泡桐丛枝病原的其他寄主进行了检测和鉴定。依据植原体16S rRNA基因设计的通用引物,采用巢式PCR检测了从泡桐丛枝病树附近采集的不同植物上的30份样品。从其中8种植物中扩增到长为1246bp的片段,序列分析表明它们都属于16SrI-D亚组,与泡桐丛枝病植原体的同源性最高,初步推断这8种植物是泡桐丛枝病的其他寄主。其中牛筋草（Eleusine indica）、狗尾草（Setaria viridis）、山药（Dioscorea opppsita）、灯笼泡（Physalis angulata）、南瓜（Cucurbita moschata ）、楸树（Catalpa bungei ）6种植物是首次报到植原体病害;并且从辣椒（Capsicum annuum）和花生（Arachis hypogaea）中检测到的植原体与以往文献报道的辣椒僵顶病及花生从枝病病原植原体不同。本研究还在楸树叶片黄化（CbY）样品中扩增到了植原体的tuf基因,其序列同源性也与泡桐丛枝病植原体最高。DAPI荧光显微镜和间接免疫荧光显微镜观察结果表明,楸树黄化植原体与PaWB-NY tuf抗血清产生特异免疫反应,并且楸树黄叶组织中的植原体含量明显低于泡桐丛枝病组织。从河北承德采集表现异常的丁香黄叶和北京采集到的黄金槐短枝样品中,通过巢式PCR扩增到了植原体16S rRNA基因,克隆测序,得到了长度为1246bp的核苷酸序列,初步证明了采集样品中含有植原体。序列分析和RFLP分析显示黄金槐短枝（ScIS）植原体属于16SrI-D亚组。丁香黄化（SoY）植株上植原体与猪屎豆丛枝植原体同源性最高,属于16SrII-A亚组,与报道的引起紫丁香丛枝病的病原不同。在丁香簇叶样品（SoP）中检测到两种植原体,分别属于16SrI-D亚组和16SrII-A亚组,推断可能是这两种植原体的复合侵染。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言和文献综述
• 1 植原体概述
• 1.1 植原体的分类
• 1.2 植原体的基因组
• 1.2.1 染色质基因组
• 1.2.2 染色质外基因组
• 1.3 植原体检测技术
• 1.3.1 电子显微镜观察
• 1.3.2 组织化学技术
• 1.3.3 血清学方法
• 1.3.4 核酸杂交技术
• 1.3.5 PCR 技术
• 1.4 植原体蛋白延伸因子（EF-Tu）研究
• 1.5 植原体的寄主范围的研究
• 2 泡桐丛枝病研究
• 2.1 发生和危害
• 2.2 泡桐丛枝病病原及生物学
• 2.3 泡桐丛枝病传播途径的研究
• 2.4 泡桐-植原体互作关系研究
• 2.4.1 染病植株组织学变化
• 2.4.2 激素的变化
• 2.4.3 蛋白质的变化
• 2.5 泡桐丛枝病的防治技术
• 3 本研究的立论依据、研究内容及意义
• 3.1 立题依据
• 3.2 研究内容及意义
• 第二章 泡桐丛枝病植原体南阳分离物延伸因子tuf 基因原核表达、抗血清的制备及其血清学关系比较
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植原体和染病苗组织培养
• 1.1.2 生化及分子生物学试剂
• 1.1.3 主要实验仪器
• 1.1.4 实验常规试剂及配制
• 1.1.5 本实验所需试剂及配制
• 1.1.6 引物设计与合成
• 1.2 方法
• 1.2.1 总DNA 提取
• 1.2.2 PaWB-NY tuf 基因的扩增
• 1.2.3 电泳
• 1.2.4 PaWB-NY tuf 基因的克隆与序列分析
• 1.2.5 PaWB-NY tuf 基因的原核表达及抗血清的制备
• 1.2.6 血清学反应
• 2. 结果与分析
• 2.1 PaWB-NY tuf 基因的克隆与序列分析
• 2.2 PaWB-NY tuf 基因的原核表达及抗血清的制备
• 2.2.1 PaWB-NY tuf 基因的原核表达载体的构建
• 2.2.2 PaWB-NY tuf 基因的诱导表达及SDS-PAGE 检测
• 2.3 血清学反应
• 2.3.1 Western blot
• 2.3.2 ACP-ELISA
• 2.3.3 Dot blot 检测
• 2.3.4 间接免疫荧光显微镜观察
• 3. 结论与讨论
• 3.1 植原体抗血清的制备
• 3.2 序列分析结果与血清学关系
• 3.3 三种血清学方法的比较
• 3.4 几种抗原制备方法的比较
• 3.5 PaWB-NY tuf 蛋白的预测分析
• 第三章 泡桐丛枝病原其他寄主的检测与鉴定
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 材料来源
• 1.1.2 克隆菌株和载体
• 1.1.3 生化及分子生物学试剂
• 1.1.4 常规实验所需试剂及配制
• 1.1.5 主要实验仪器
• 1.1.6 引物设计与合成
• 1.1.7 荧光显微镜观察所用试剂
• 1.1.8 植物总DNA 提取试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 总DNA 提取
• 1.2.2 田间采集植物植原体16S rRNA 基因的PCR 扩增
• 1.2.3 楸树黄化植原体的tuf 基因的PCR 扩增
• 1.2.4 琼脂糖电泳
• 1.2.5 16S rRNA 基因和tuf 基因的克隆及序列分析
• 1.2.6 楸树黄叶病组织DAPI 染色显微镜观察
• 1.2.7 间接免疫荧光显微镜观察
• 2. 结果与分析
• 2.1 采集作物、杂草和树木症状表现及采集地生境
• 2.2 采集样品的16S rRNA 基因 PCR 检测结果
• 2.3 CbY 植原体的tuf 基因的PCR 扩增
• 2.4 PCR 产物的克隆及重组质粒PCR 鉴定结果
• 2.5 16S rRNA 基因序列测定及分析
• 2.6 CbY 植原体tuf 基因序列测定及分析
• 2.7 CbY 组织DAPI 染色荧光显微镜观察
• 2.8 CbY 组织的间接免疫荧光观察
• 3. 结论与讨论
• 第四章 两种植物植原体病害的初步检测与鉴定
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 样品采集
• 1.1.2 菌株和载体
• 1.1.3 生化及分子生物学试剂
• 1.1.4 常规实验所需试剂及配制
• 1.1.5 主要实验仪器
• 1.1.6 引物设计与合成
• 1.2 方法
• 1.2.1 总DNA 提取
• 1.2.2 田间采集植物植原体16S rRNA 基因的PCR 扩增
• 1.2.3 16S rRNA 基因的克隆及序列分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 采集植物材料
• 2.2 16S rRNA 基因 PCR 检测结果
• 2.3 PCR 产物的克隆及重组质粒酶切鉴定结果
• 2.4 16S rRNA 基因序列测定及分析
• 2.5 丁香簇叶中植原体16S rDNA 序列SoP-2 的RFLP 分析
• 3. 结论与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表的学术论文