论文题目: 磁性微球的制备及其在基因组脱氧核糖核酸提取上的应用
论文类型: 硕士论文
论文专业: 药物分析学
作者: 张立明
导师: 万谦宏
关键词: 磁分离,磁性微球,聚乙二醇,小牛胸腺,脱氧核糖核酸,弗仑德里希吸附模型,酿酒酵母,玉米仁
文献来源: 天津大学
发表年度: 2005
论文摘要: 随着生命科学和生物工程的快速发展,磁分离技术以其简便而快速的分离应用,适于多样化的样品基质,易自动化和微型化的特性正成为生命科学领域不可缺少的手段。本文以本实验室采用模板法和化学共沉淀法制备的三种不同基质类型的磁性微球和硅胶为吸附剂,聚乙二醇（PEG）和氯化钠（NaCl）组成的吸附液,研究了小牛胸腺脱氧核糖核酸（DNA）在基于硅醇基的固相载体上的吸附行为。实验结果表明,吸附液组成为20 %（w/v）PEG和2.0 mol/L NaCl和洗脱时间为10 min的条件下,DNA的回收率可达80%。磁性微球的提取效率与硅胶相仿,但是由于省去了离心分离步骤,缩短了核酸模板制备时间,有利于实现自动化操作。为了研究DNA在磁性微球上的吸附机理,我们进一步研究了从PEG和NaCl组成的吸附液中,DNA被吸附至固相载体上的吸附等温线,研究中发现,DNA的吸附可用弗仑德里希吸附模型加以描述,相关系数均可达0.994以上。采用研磨法粉碎哺乳动物组织小牛胸腺和植物组织玉米仁,经细胞裂解液破细胞后,以硅醇基表面的磁性微球为固相载体,进行基因组DNA磁分离提取,得到了片段约20 kb,A260/A280大于1.77的高纯度DNA。将磁性微球用于野生酿酒酵母菌基因组DNA的提取。采用两种不同的方法部分和完全裂解酿酒酵母细胞壁,获得了片段分别为5 kb和20 kb左右,且A260/A280在1.77-1.89之间的DNA片段。对所制备的磁性微球用硅烷化试剂表面改性后,将不同表面官能团的磁性微球用于小牛胸腺、玉米仁和野生酿酒酵母基因组DNA的提取。与硅醇基表面的磁性微球一样,获得了较好的结果。
论文目录:
中文摘要
ABSTRACT
前言
第一章 导论与综述
1.1 磁性粒子的制备与修饰
1.1.1 磁性高分子微球制备方法
1.1.2 磁性离子的表面修饰
1.2 磁性粒子在生物磁分离技术上的应用
1.2.1 磁性粒子在细胞标记和细胞分离上的应用
1.2.2 蛋白质和多肽的磁性分离与纯化
1.2.3 磁性微球在核酸纯化上的应用
1.2.3.1 DNA/RNA 结合蛋白分离
1.2.3.2 mRNA 分离
1.2.3.3 DNA 分离
1.2.3.3.1 传统酚－氯仿抽提法
1.2.3.3.2 固相提取法
1.3 本文研究目标与内容
1.3.1 研究目标
1.3.2 研究内容
第二章 实验部分
2.1 材料、仪器、试剂
2.1.1 试剂
2.1.2 材料
2.1.3 仪器
2.2 溶液配置
2.3 试验方法
2.3.1 磁性微球的制备及修饰
2.3.1.1 Affimag Z1－01 磁性微球的制备及修饰
2.3.1.2 Affimag Z2－01 磁性微球的制备及修饰
2.3.1.3 Affimag C1－01 磁性微球的制备及修饰
2.4 DNA 提取
2.4.1 制备小牛胸腺基因组DNA 标准品
2.4.2 DNA 磁分离
2.4.2.1 磁性微球和硅胶对小牛胸腺 DNA 的可逆吸附
2.4.2.2 磁性微球和硅胶对小牛胸腺DNA 的吸附条件优化
2.4.2.3 磁性微球和硅胶对小牛胸腺DNA 的吸附回收率试验
2.4.3 实际样品基因组DNA 的固相提取
2.4.3.1 小牛胸腺组织基因组DNA 的固相提取
2.4.3.2 玉米基因组DNA 的固相提取
2.4.3.3 野生酿酒酵母的培养及基因组DNA 提取
2.4.3.3.1 野生酿酒酵母的培养
2.4.3.3.2 野生酿酒酵母基因组 DNA 的固相提取
2.4.3.4 全血基因组DNA 的提取
2.5 琼脂糖凝胶电泳
2.5.1 琼脂糖凝胶的制备
2.5.2 琼脂糖凝胶电泳检测DNA
第三章 结果与讨论
3.1 磁性微球（Magnetic microspheres）
3.1.1 Affimag Z1 系列磁性微球
3.1.2 Affimag Z2－01 磁性微球
3.1.3 AffimagC1－01 磁性微球
3.2 浓盐法制备小牛胸腺基因组 DNA
3.3 DNA 在基于硅醇基的固相载体上的可逆吸附
3.3.1 DNA 固相吸附条件优化
3.3.1.1 聚乙二醇（PEG_(8000)）对DNA 吸附的影响
3.3.1.2 氯化钠浓度对DNA 吸附的影响
3.3.1.3 洗脱时间的影响
3.3.1.4 共存蛋白质对回收DNA 纯度的影响
3.3.1.5 其他影响因素
3.4 DNA 在改性的Affimag Z1 系列磁性微球上的可逆吸附
3.4.1 改性磁性微球结构
3.4.2 改性磁性微球吸附条件优化
3.5 DNA 在磁性微球及硅胶上的吸附模型的建立
3.6 DNA 提取机理研究
3.6.1 DNA 吸附机理
3.6.2 双水相系统在DNA 吸附上的应用
3.7 磁分离技术在实际样品基因组 DNA 提取上的应用
3.7.1 磁性微球和硅胶在提取小牛胸腺基因组DNA 上的应用
3.7.2 磁性微球和硅胶在提取玉米基因组 DNA 上的应用
3.7.3 野生酿酒酵母基因组 DNA 的固相提取
3.7.3.1 酵母简介
3.7.3.2 固相提取在快速提取酵母小片段基因组 DNA 上的应用
3.7.3.3 酶解法用于酿酒酵母基因组 DNA 的固相提取
3.7.3.4 蜗牛酶在酵母原生质体形成上的应用
3.7.4 磁性微球和硅胶在提取全血基因组 DNA 上的应用
3.7.4.1 变性盐的 pH 影响因素考察
3.7.5 琼脂糖凝胶电泳检测
第四章 结论与展望
4.1 结论
4.2 展望
参考文献
发表文章和参加科研情况
附录
致 谢
发布时间: 2007-04-17
参考文献
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