梁艳丽1何勤2王旭2（1四川遂宁市中心医院629000；2四川昆明医学院第二附属医院血液科650101）
【中图分类号】R733.7【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)35-0010-03
【摘要】目的探讨HLA-B27基因与云南汉族白血病患者的关联性。方法运用序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）扩增方法检测26例云南昆明汉族白血病的患者HLA-B27基因的分布，对照组为62例来自云南昆明汉族无血缘关系的健康者。结果26例白血病患者中，HLA-B27基因阳性为1例，占3.8%；在62例对照组中，有3例为阳性，占4.8%。两者无明显差异。结论研究没有发现HLA-B27基因与云南汉族白血病具有相关性，也没有发现HLA-B27基因在本组白血病患者与正常健康人中的分布有差异性，这可能与白血病的复杂的发病机制，分类较多及人群地理分布及样本量有关。
【关键词】HLA-B27基因云南汉族白血病人类白细胞抗原
人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen，HLA）复合体是位于第6号染色体短臂（6p21.31）的一组紧密连锁的基因群，DNA长度约3600kb。HLA-B27抗原为HLA-Ⅰ类基因B座位上的抗原，是一组紧密相关的组织相容性抗原。1973年Brewerton报道了HLA-B27与强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis，AS)病因及发病机制密切相关[1]。近几年来，研究发现HLA与白血病亦有相关性。白血病是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病,到目前为止，该病的确切发病机制尚不清楚。多数学者认为，白血病是由物理、化学、生物及遗传等多方面因素共同作用的结果。据文献报道[2]，具有高度多态性并与抗原呈递和识别有关的HLA分子，可能是导致白血病的重要遗传因素之一。HLA-B27基因与白血病是否有关联性，关联性如何，我们将通过建立序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）方法对HLA-B27基因与云南汉族白血病患者的关联性进行初步探讨。
1材料和方法
1.材料
1.1病例组昆明医学院第二附属医院血液科临床确诊为白血病的患者，共26例。其中男性12例，女性14例，年龄5～70岁，平均年龄42岁。急性髓细胞白血病（AML）11例，急性淋巴细胞白血病（ALL）8例，慢性髓细胞性白血病（CML）3例，慢性淋巴细胞性白血病（CLL）3例，急性双表型白血病1例。
1.2对照组云南昆明汉族健康群体62例,其中男性31例，女性31例，年龄14～75岁，平均年龄44岁。
1.3标本要求
所有患者均进行了血常规、外周血涂片分类、骨髓细胞学、组织化学染色、骨髓病理学、白血病细胞免疫分型及染色体核型等检查，部分患者进行了融合基因检测。
1.4主要试剂
PCR反应试剂10×PCRBuffer，2×GCBufferⅠ，rTaq酶，LaTaq酶均购自中国大连TakaraBiotech公司
2.方法
2.1样本DNA的提取
血样处理：抽取静脉血5-6ml，置于无菌真空管中，EDTA抗凝，用传统酚/氯仿抽提法
2.2DNA浓度测定
取10ulddH2O中，使用紫外分光光度仪检测每份DNA溶液的OD280值，计算OD260/OD280，比值在1.7-1.9范围内为正常（浓度约为0.2-2.4ug/ul）。
2.3PCR反应
根据序列特异性引物扩增法（PCR-SSP）设计HLA-B27基因的引物序列[13]，然后进行HLA-B27基因片段的扩增。具体如下：
（2）扩增HLA-B27基因片段
①引物序列：上游引物为：5’GCTACGTGGACGACACGCT3’，下游引物1为：5’CTCGGTCAGTCTGTGCCTT3’，下游引物2为：5’TCTCGGTAAGTCTGTGCCTT3’。
②PCR反应体系：10×PCRBuffer(Mg2+Plus)2.5ul，dNTPMixture(各2.5mM)2.0ul，上下游引物（25ummol/L）0.5ul，模板DNA（25ng/ul）0.5ul，TaKaRarTaq酶（5U/ul）0.125ul，ddH2O18.8ul，共25ul。
③PCR扩增条件：94℃预变性2min，95℃30sec、65℃50sec、72℃40sec，扩增10循环；95℃30sec、62℃50sec、72℃40sec，扩增20循环；72℃延伸10min，12℃10min。
(3）电泳，电泳结束后，放置凝胶成像系统紫外灯下观察结果并拍摄其照片。
2结果
1.HLA-B27基因在云南白血病患者中的电泳结果
1.2HLA-B27基因片段的扩增结果：与预计大小相符，扩增片段为149bp，如图2-2，图2-3。
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注：图2-2为B27下游引物为1的扩增产物
图2-3为B27下游引物为2的扩增产物
2结果
26例白血病患者中，HLA-B27基因阳性为1例，占3.8%；在62例对照组中，有3例为阳性，占4.8%。采用四格表X2检验，得出X2值为0.042，P=1.00，P﹥0.05，所以HLA-B27基因在白血病组与对照组中无统计学差异。
3讨论
人类白细胞抗原（HumanLeukocyteAntigen,HLA）系统是目前已知的最复杂的免疫遗传多态性系统。目前研究指出：HLA抗原与人类疾病的发生、发展以及预后有着密切的关系。据文献报道[2]具有高度多态性并与抗原呈递和识别有关的HLA分子，可能是导致白血病的重要遗传因素之一。
在对白血病的HLA-B相关性研究中，发现HLA-B等位基因中HLA-B27与白血病具有相关性，可能是白血病的易感基因，如戴云鹏[3]等对ALL患者进行HLA-B等位基因多态性的研究，认为B27等位基因对ALL具有易患性，是ALL发生的危险标志之一。高素青等人[4]发现ALL患者HLA-B的等位基因中，HLA-B27等位基因频率高于正常对照组。但在国外对ALL的研究中尚未发现HLA-B27与ALL有相关性。李丹[6]研究发现在CML患者HLA-B27基因频率明显增高。
本实验中对26例云南汉族白血病患者中的HLA-B27基因进行检测，结果显示有1例为阳性，阳性率为3.8%；正常对照组中，HLA-B27基因阳性率为4.8%。经四格表X2检验，两者无统计学差异。在对云南汉族白血病与HLA-B27基因的相关性研究中，并没有发现云南汉族白血病患者与云南汉族健康人群有差异性，也挥蟹⑾諬LA-B27与白血病具有相关性。对于本研究结果与其他相关研究结果不一致的解释，可能有以下几个方面的原因：①所选样本来源于不同的人群。因为HLA基因频率的分布与种族、地域等有关。不同种族、地域的人群HLA基因频率的分布是不同的，从而可造成一些偏移。②疾病的不同类型也可影响HLA基因的分布,白血病种类繁多、发病机制复杂，这也是影响因素之一。③所选样本量太少，所得出的结果只能反映本组白血病代表的一部分云南汉族白血病群体的HLA-B27分布，而不能代表全部。这将有待于更大样本量和更为深入的研究。
本研究中，我们应用PCR-SSP方法对HLA-B27基因与云南汉族白血病的相关性进行了研究，对云南汉族白血病患者中的HLA-B27基因分布进行了初步的探讨，从而有助于了解HLA-B27基因在白血病中的作用，并为云南汉族白血病的发病机制提供遗传学方面的参考数据。
参考文献
[1]甘茂周.HL-B27亚型及其与强直性脊椎炎的关系[J].国外医学:输血及血液学分册,1999，22(3)：163.
[2]WardMM,BarbaroNM,LaxerKD,etal.Preoperativevalproateadministrationdosenotincreasebloodlossduringtemporallobectomy[J].Epilepsia,1996,37(3):98-102.
[3]戴云鹏,阎文英,陈力军等.小儿急性淋巴细胞白血病HLA-A、B、D等位基因多态性研究[J].白血病淋巴瘤,2006,15:330-332.
[4]高素青，邓志辉,金士正等。中国南方汉族急性淋巴细胞白血病与HLA基因相关性研究[J].中国实验血液学杂志,2005,13（2）：210-214.
[5]CortesJ,FayadL,KantarjianH,etal.AssociationofHLAphenotypeandresponsetointerfe-ron-alphainpatientswithchronicmyelogenousleukemia[J].Leukemia,1998,12(4):455-462.
[6]李丹,郄斌,于燕等.HLA与慢性粒细胞白血病相关性的调查[J].中国输血杂志，2001,8:14-4.