猪STEAP4基因的分子特性及功能分析

论文摘要

研究表明肥胖是一种慢性炎症状态。近年来,代谢研究的前沿是阐明炎症信号途径与糖脂代谢的关系。STEAP4（six transmembrane epithelial antigen of the prostate 4）是新近发现的前列腺6次跨膜上皮抗原家族的一员,该家族成员具有6次跨膜区和三价铁离子还原酶样跨膜结构域。其最初作为一种TNFa诱导表达的蛋白被确认,近来的研究显示STEAP4是一个多功能分子,它在糖脂代谢、抗炎症、体内代谢稳态、细胞增殖与凋亡、肿瘤、及金属离子还原方面扮演重要角色,被看作是处于癌症与糖脂代谢十字路口的调控蛋白。本论文主要研究了猪STEAP4基因的分子特性及其表达调控。实验通过RT-PCR方法克隆了猪STEAP4基因全编码序列,采用生物信息学和分子生物学技术分析该基因的核苷酸和氨基酸序列特性,以半定量RT-PCR的方法对STEAP4基因组织表达谱进行了分析,并异位超表达STEAP4检测细胞中ATP含量及炎症因子TNFa的表达变化。为进一步研究STEAP4的表达调控情况,我们扩增了猪STEAP4启动子区域,并用双荧光素酶报告系统确定其启动子及其不同截短的活性情况,结合Genomatix软件预测的转录因子结合位点,研究相关转录因子C/EBPα、C/EBPβ、KLF6和PPARy对STEAP4转录的调控作用,最后研究了炎症刺激物LPS及炎症因子resistin对STEAP4表达的调控。证明了猪STEAP4变体具有一定抗炎作用,其基因转录受C/EBPβ调控。研究结果为STEAP4基因在猪模型中的进一步功能分析提供了平台。本论文获得的具体实验结果如下：1.扩增获得了猪STEAP4及其变体的序列,全长STEAP4开放读码框覆盖1413bp,编码一个470个氨基酸的多肽,相应的STEAP4变体（STEAP4v）编码了缺失第三外显子的前部分而仅含353个氨基酸的多肽。猪STEAP4基因组大约跨越23kb,位于基因组的9q11.1,包含五个外显子和四个内含子。2.通过组织表达谱分析,我们发现猪STEAP4 mRNA存在广谱表达的特性,在脂肪,肾,小脑,心脏,肺中高度表达,在肝脏,脾,小肠中也有一定的表达量,而在大脑,胃,大肠,肌肉中表达量最低,而其变体总体表达量比正常剪切的STEAP4表达量要低,且在肺中表达量最高,在脂肪组织及心脏中也有少量表达,其他组织中几乎没有检测到表达。3.在HepG2细胞中超表达STEAP4及其STEAP4v,通过检测细胞中ATP的浓度来反映细胞状态,发现异位超表达STEAP4不影响细胞状态,而异位超表达STEAP4v细胞活性下降。另外,在小鼠巨噬细胞中超表达STEAP4及其变体,发现STEAP4v对炎症因子TNFa的表达具有下调作用,预示着STEAP4v发挥着一定的抗炎作用。4.利用猪基因组DNA扩增获得了猪STEAP4启动子（-1402/+10bp）,并用双荧光素酶方法分别在HepG2肝癌细胞系和IBRS2猪肾细胞系中检测其启动子活性。进一步对该启动子进行不同长度的截短（-1402/+10、-801/+10、-546/+10、-349/+10、-191/+10、-101/+10、-46/+10bp）,并检测了截短后不同长度的启动子活性,结果发现-801/+10bp区段具有最大启动子活性。5.生物信息学分析显示,在猪STEAP4启动子-801/+10bp区段上具有脂肪形成相关的转录因子C/EBPα, C/EBPp, KLF6和PPARy的结合位点,在HepG2细胞中分别超表达上述转录因子和-801/+10bp区段启动子,发现C/EBPβ能够上调STEAP4启动子活性而C/EBPa, KLF6, PPARy对其没有显著的调控作用；与此同时通过比对C/EBPa和C/EBPβ对猪和小鼠STEAP4相同长度区段（-801/+10bp）启动子的调控情况,发现与猪STEAP4启动子的调控不同,小鼠STEAP4 （-801/+10bp）启动子受到C/EBPa和C/EBPp两者的上调作用。另外,在HepG2细胞中超表达C/EBPβ之后,定量PCR检测到STEAP4 mRNA表达量上升。6.通过将C/EBPβ与不同长度的启动子共转染探索了C/EBPβ可能的作用位点区段,发现C/EBPβ作用在-101/-46bp区段。进一步通过突变STEAP4启动子上的3个C/EBP预测位点,显示-73/-59bp的C/EBP保守位点突变能够撤销C/EBPβ的上调作用。7.利用炎症刺激物LPS、炎症因子resistin作为诱导物,定量RT-PCR检测显示,LPS、resistin刺激都能够显著上调猪间充质干细胞（MSCs）和HepG2细胞中STEAP4的表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 STEAP4家族及基因特性
• 1.1.1 STEAP家族的特征
• 1.1.2 STEAP4基因结构
• 1.1.3 STEAP4基因SNPs研究
• 1.1.4 STEAP4蛋白结构
• 1.1.5 STEAP4的细胞定位
• 1.1.6 STEAP4的金属还原酶活性
• 1.1.7 STEAP4的组织分布情况
• 1.2 STEAP4功能研究
• 1.2.1 炎症因子调控STEAP4表达
• 1.2.2 STEAP4在脂肪细胞分化过程中表达
• 1.2.3 STEAP4与胰岛素敏感性相关因子关系
• 1.2.4 STEAP4整合炎症和代谢应答
• 1.2.5 STEAP4参与细胞凋亡及增殖
• 1.2.6 其他因子调控STEAP4的表达
• 1.3 STEAP4与疾病的发生
• 1.3.1 STEAP4与前列腺癌的发生
• 1.3.2 STEAP4与人的肥胖及胰岛素抵抗
• 1.3.3 STEAP4与颈动脉粥样硬化
• 1.3.4 STEAP4与关节炎及风湿性关节炎
• 1.4 C/EBPβ相关介绍
• 1.5 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 RNA与cDNA样品
• 2.1.2 DNA样品
• 2.1.3 培养基、工具酶及试剂盒
• 2.1.4 常用溶液配方
• 2.1.5 菌株与细胞
• 2.1.6 主要实验仪器
• 2.1.7 分子生物学相关软件
• 2.2 方法
• 2.2.1 STEAP4基因的克隆
• 2.2.1.1 组织总RNA的提取
• 2.2.1.2 组织总RNA的纯化
• 2.2.1.3 总RNA质量和纯度检测
• 2.2.1.4 扩增STEAP4基因cDNA片段的引物设计
• 2.2.1.5 总cDNA模板的获取
• 2.2.1.6 PCR反应扩增目的片段
• 2.2.1.7 PCR扩增产物的回收与纯化
• 2.2.1.8 扩增产物的鉴定（克隆和测序）
• 2.2.2 STEAP基因组序列的分析
• 2.2.3 染色体电子定位分析
• 2.2.4 半定量RT-PCR进行猪STEAP4基因组织表达谱分析
• 2.2.4.1 组织表达谱的引物设计
• 2.2.4.2 STEAP4基因和GAPDH基因扩增的指数期循环数确定
• 2.2.4.3 半定量RT-PCR扩增的反应条件
• 2.2.4.4 半定量结果分析
• 2.2.5 检测细胞中ATP的含量
• 2.2.5.1 真核表达载体构建
• 2.2.5.2 大量提取质粒
• 2.2.5.3 质粒浓度和纯度的检测
• 2.2.5.4 细胞培养
• 2.2.5.5 细胞转染
• 2.2.5.6 细胞中ATP检测方法
• 2.2.5.7 细胞中蛋白质总量测定
• 2.2.5.8 数值处理
• 2.2.6 定量RT-PCR检测STEAP4超表达后细胞中TNFα含量变化
• 2.2.6.1 细胞mRNA的提取、纯化、检测和反转录
• 2.2.6.2 定量检测引物设计
• 2.2.6.3 Real-Time PCR扩增条件
• 2.2.6.4 数据统计分析
• 2.2.7 STEAP4基因启动子扩增
• 2.2.7.1 基因组DNA的提取
• 2.2.7.2 猪和小鼠STEAP4基因启动子扩增引物设计
• 2.2.7.3 猪和小鼠STEAP4基因启动子的扩增
• 2.2.8 启动子活性检测
• 2.2.8.1 荧光素酶载体的构建
• 2.2.8.2 双荧光素酶报告系统检测启动子活性
• 2.2.8.3 试验数据统计分析
• 2.2.9 LPS和resistin刺激对STEAP4表达的影响
• 3 结果与分析
• 3.1 猪STEAP4基因全长cDNA的克隆与序列分析
• 3.1.1 猪STEAP4基因全编码区cDNA和变体的克隆
• 3.1.2 猪STEAP4序列分析
• 3.1.3 猪STEAP4基因组结构分析
• 3.2 猪STEAP4染色体定位
• 3.3 猪STEAP4及其变体的组织表达谱
• 3.4 猪STEAP4对HepG2细胞中ATP含量的影响
• 3.5 STEAP4及其变体超表达对RAW264.7巨噬细胞中TNFα表达量的影响
• 3.6 猪STEAP4基因启动子区的克隆及顺式作用元件预测分析
• 3.7 猪STEAP4启动子区活性检测
• 3.8 脂肪细胞分化相关转录因子对STEAP4启动子的调控作用
• 3.9 C/EBPα、C/EBPβ对STEAP4表达量的影响
• 3.9.1 C/EBPα、C/EBPβ对STEAP4 mRNA表达量的影响
• 3.9.2 C/EBPα、C/EBPβ对猪和小鼠STEAP4启动子调控对比
• 3.10 C/EBPβ对不同区段STEAP4启动子活性的影响
• 3.11 C/EBPβ对STEAP4启动子结合位点的依赖性
• 3.12 脂多糖（LPS）对猪MSC细胞中STEAP4基因表达的影响
• 3.13 Resistin对HepG2细胞中STEAP4表达的调控
• 4 讨论
• 4.1 猪STEAP4基因的结构分析
• 4.2 猪STEAP4基因的染色体定位
• 4.3 猪STEAP4基因表达的组织差异
• 4.4 猪STEAP4基因变体
• 4.5 猪STEAP4对细胞中ATP含量的影响
• 4.6 猪STEAP4影响巨噬细胞中TNFα的表达
• 4.7 猪STEAP4基因启动子活性分析
• 4.8 猪STEAP4基因受到C/EBPβ的调节作用
• 4.9 C/EBPβ在猪STEAP4启动子上具体的结合位点探讨
• 4.10 猪STEAP4对脂多糖（LPS）的应答反应
• 4.11 人STEAP4对resistin的应答反应
• 5 结论与创新点
• 5.1 结论
• 5.2 创新点
• 参考文献
• 研究生在读期间论文发表情况
• 致谢