REV感染SPF鸡中IL-6、IL-18和IFN-γ的定量检测

论文摘要

白细胞介素6又称B细胞刺激因子，是诱导B细胞产生抗体的必需因子之一，其分泌水平的高低可以反映机体的体液免疫功能。白细胞介素18又称为γ-干扰素诱生因子，是一种具有多向和多层次免疫调节功能的细胞因子。IFN-γ是一种免疫调节的多效性因子，哺乳动物和禽IFN-γ被用作感染机体细胞介导免疫的指示器。当前，免疫抑制病给我国集约化养鸡业带来了很大危害，禽网状内皮组织增生症病毒感染后可导致体液和细胞介导免疫应答的严重抑制已有很多报道，了解免疫抑制机理并制定提高鸡的免疫应答策略正成为当前的研究热点。本研究以禽网状内皮组织增生症病毒人工接种SPF鸡造成的免疫抑制为模型，对ChIL-6、ChIL-18和ChIFN-γ在免疫抑制中可能发挥的作用进行了初步探讨。研究内容主要包括三部分：1.实时荧光定量RT-PCR检测禽网状内皮组织增生症病毒感染SPF鸡主要免疫器官中IL-18基因表达量的研究。为了研究ChIL-18基因在禽网状内皮组织增生症病毒感染SPF鸡体内的表达水平，130只1日龄SPF鸡随机分为2组，禽网状内皮组织增生症病毒处理组和生理盐水对照组。每个处理组分别在感染后7、14、21、28、35、42和49d随机取8只鸡处死，迅速取脾脏、胸腺和法氏囊样品用于RNA提取。应用本实验室已建立的SYBR GreenⅠ染料实时荧光定量RT-PCR方法，比较处理组和对照组ChIL-18基因mRNA相对表达量的变化。结果显示，与对照组相比，处理组脾脏、胸腺和法氏囊中IL-18的分泌水平除感染后14d脾脏外，在感染后7d、14d、21d、28d、35d、42d和49d均显著升高（P<0.05）。2.分别成功建立了检测ChIL-6和ChIFN-γ的SYBR Green Ι荧光定量RT-PCR方法。根据GenBank上ChIL-6和ChIFN-γ基因的序列，在保守区设计并合成各自特异引物，并以核糖体蛋白亚基4基因为内参，采用SYBR GreenⅠ染料以建立实时荧光定量RT-PCR检测方法。将ChIL-6、ChIFN-γ与核糖体蛋白亚基4部分基因克隆至pMD18-T载体上，以各阳性质粒作为标准品，构建标准曲线，并进行熔解曲线分析。结果表明，该方法对ChIL-6和ChIFN-γ mRNA的扩增效率均为107%左右，线性范围为10-210-6，相关系数为0.998以上，最低能检出100拷贝/μL；从RNA提取到荧光定量PCR结束的检测周期只需4h。本研究所建立的ChIL-6和ChIFN-γ基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短，为在转录水平对ChIL-6和ChIFN-γ的定量分析奠定了基础。3.实时荧光定量RT-PCR检测禽网状内皮组织增生症病毒感染SPF鸡主要免疫器官中IL-6和IFN-γ基因表达量的研究。为了研究ChIL-6和ChIFN-γ基因在禽网状内皮组织增生症病毒感染SPF鸡体内的表达水平，120只1日龄SPF鸡随机分为2组，禽网状内皮组织增生症病毒处理组和生理盐水对照组。每个处理组分别在感染后7、14、21、28、35、42和49d随机取6只鸡处死，迅速取脾脏、胸腺和法氏囊样品用于RNA提取。应用已建立的SYBR GreenⅠ染料实时荧光定量RT-PCR方法，比较处理组和对照组ChIL-6和ChIFN-γ基因mRNA相对表达量的变化。结果显示，与对照组相比，处理组脾脏、胸腺和法氏囊中IL-6和IFN-γ的分泌水平在所有时间点均显著升高（P＜0.05）或极显著升高（P＜0.01）。本实验为探讨禽网状内皮组织增生症病毒感染的免疫抑制机理打下了一定基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1.1 白细胞介素 6 的研究进展
• 1.1.1 IL-6 的生物学特性
• 1.1.2 IL-6 的检测方法
• 1.1.3 IL-6 在兽医生产上的应用进展
• 1.2 白细胞介素 18 的研究进展
• 1.2.1 IL-18 的发现
• 1.2.2 IL-18 的分布及产生
• 1.2.3 IL-18 的合成与表达
• 1.2.4 IL-18 与机体防御
• 1.2.5 鸡白细胞介素 18 的研究进展
• 1.3 γ干扰素的研究进展
• 1.3.1 IFN 的发现及分类
• 1.3.2 IFN-γ的分子结构
• 1.3.3 IFN-γ的诱生
• 1.3.4 IFN-γ与神经-内分泌-免疫网络
• 1.3.5 IFN-γ的应用
• 1.4 禽网状内皮组织增生症研究进展
• 1.4.1 禽网状内皮组织增生症病原学
• 1.4.2 禽网状内皮组织增生症流行病学
• 1.4.3 禽网状内皮组织增生症发病机理
• 1.4.4 临床症状及病理变化
• 1.4.5 诊断与防治
• 1.5 荧光定量 PCR 研究进展
• 1.5.1 荧光定量 PCR 的主要原理
• 1.5.2 几种荧光定量 PCR
• 1.5.3 荧光定量 PCR 与常规 PCR 的比较
• 1.5.4 荧光定量 PCR 技术在实践中的应用
• 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与载体
• 2.1.2 实验动物与病毒
• 2.1.3 试剂与耗材
• 2.1.4 仪器与设备
• 2.1.5 实验室常用各种培养基和溶液的配制
• 2.1.6 引物设计及合成
• 2.2 方法
• 2.2.1 REV 感染 SPF 鸡动物实验
• 2.2.2 实时荧光定量 RT-PCR 检测 REV 感染 SPF 鸡主要免疫器官 IL-18 基因表达量的研究
• 2.2.3 鸡白细胞介素 6 和γ干扰素 SYBR GreenⅠ荧光定量 RT-PCR 方法的建立
• 2.2.4 实时荧光定量 RT-PCR 检测 REV 感染 SPF 鸡主要免疫器官 IL-6 和 IFN-γ基因表达量的研究
• 结果与分析
• 3.1 REV 感染 SPF 鸡动物实验
• 3.1.1 临床症状
• 3.1.2 增重影响
• 3.1.3 免疫器官指数影响
• 3.2 实时荧光定量 RT-PCR 检测 REV 感染 SPF 鸡主要免疫器官 IL-18 基因表达量的研究
• 3.2.1 脾脏 IL-18 相对表达量
• 3.2.2 胸腺 IL-18 相对表达量
• 3.2.3 法氏囊 IL-18 相对表达量
• 3.3 鸡白细胞介素 6 和γ干扰素 SYBR GreenⅠ荧光定量 RT-PCR 方法的建立
• 3.3.1 IL-6 和 IFN-γ部分基因重组质粒的构建
• 3.3.2 RPL4 部分基因重组质粒的构建
• 3.3.3 荧光定量 PCR 建立
• 3.3.4 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR 的建立
• 3.4 实时荧光定量 RT-PCR 检测 REV 感染 SPF 鸡主要免疫器官 IL-6 和 IFN-γ基因表达量的研究
• 3.4.1 脾脏 IL-6 相对表达量
• 3.4.2 脾脏 IFN-γ相对表达量
• 3.4.3 胸腺 IL-6 相对表达量
• 3.4.4 胸腺 IFN-γ相对表达量
• 3.4.5 法氏囊 IL-6 相对表达量
• 3.4.6 法氏囊 IFN-γ相对表达量
• 讨论
• 4.1 REV 感染 SPF 鸡动物实验的致病性观察
• 4.2 实时荧光定量 RT-PCR 检测 REV 感染 SPF 鸡主要免疫器官 IL-18 基因表达量的研究
• 4.3 鸡白细胞介素 6 和γ干扰素 SYBR GreenⅠ荧光定量 RT-PCR 方法的建立
• 4.4 实时荧光定量 RT-PCR 检测 REV 感染 SPF 鸡主要免疫器官 IL-6 和 IFN-γ基因表达量的研究
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况