丙型肝炎病毒NS4B蛋白的功能

论文题目: 丙型肝炎病毒NS4B蛋白的功能

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 郑义

导师: 叶林柏

关键词: 丙型肝炎病毒,非结构蛋白,微点阵技术,非折叠蛋白反应

文献来源: 武汉大学

发表年度: 2005

论文摘要: 丙型肝炎病毒(HCV)是引起丙型肝炎的病原体,已成为世界范围内的公共健康问题,是慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要原因。尽管还没有合适的细胞可培养HCV,但它编码的蛋白质在体内和体外己被鉴定。HCV编码一个多聚蛋白,在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下,产生至少十个不同的蛋白,分为结构蛋白(core、E1、E2)和非结构蛋白(NS2-NS5B)。目前对HCV的研究集中于单个的HCV蛋白的功能,试图揭示HCV的致病机制。 在HCV编码的所有蛋白中,NS4B的功能最为不清楚。本研究旨在研究NS4B的功能,了解其在HCV致病中的作用。常规的研究基因的方法常常费时且范围有限。DNA微点阵技术为检测基因的表达水平提供了前所未有的视角,从而发现蛋白在复杂的调节网络中的作用。 用pCDNA3.1(-)和重组的pCDNA3.1(-)NS4B质粒转染HeLa细胞,用G418筛选稳定转染了质粒的细胞,用RT-PCR和western blot分析证实了NS4B能在HeLa细胞中表达,对照没有。然后用微点阵技术在HeLa细胞中分析NS4B对2308个信号途径相关的基因的影响,为了避免错误,同一份标本自身杂交和重复实验,证明有很好的重复性;并且选择杂交信号的比值,如Cy5/Cy3>2.5的基因视为被NS4B诱导;如Cy3/Cy5>2.5的基因则视为被NS4B抑制。有90个基因符合这个标准,其中34个基因被上调,56个基因被下调。在34个基因上调基因中,NPTXl的改变达到14.44倍,Dickkopf homolog 1(DKKl),syndecan 1(SDC1),AP1的表达改变均超过5倍。10个下调最为显著的基因为:AKRlCl,IL10RA,substance K,TGFβ,leukemia inhibitory factor receptor(LIFR),H factor(complement)-like 3(HFL3),fibronectin 1(FNl),adducin 3(gamma)inase-like 3(DP-YSL3)。这些基因的表达改变超过8倍。为了了解这些基因的功能,将它们分为7类:(1)肿瘤相关的基因;(2)

论文目录:

第一章 基因芯片

1.1 生物芯片简介

1.2 基因芯片的原理及类型

1.2.1 原位合成法

1.2.2 直接点样芯片

1.2.3 原位合成法与直接点样法比较

1.2.4 PCR芯片

1.3 样本制备，标记与芯片杂交

1.3.1 样本制备

1.3.2 样本标记

1.3.3 芯片杂交

1.4 图像处理与数据处理

1.4.1 图像处理

1.4.1.1.生物芯片荧光图像的视图处理

1.4.1.2.图像处理

1.4.1.3.图像的平滑处理与赝像，污染的去除

1.4.1.4.样品的识别

1.4.1.5.背景的确定

1.4.1.6.样点信号的确定

1.4.1.7.芯片数据归一化

1.5 聚类分析

1.5.1.系统聚类分析

1.5.2.逐步聚类分析

1.5.3.自组图分析

1.5.4.主成分分析

1.5.5.时间系列分析

1.5.6.其他系统分析方法

1.6 基因芯片的应用

1.6.1 基因芯片在测序和及再测序中的应用

1.6.1.1 杂交测序技术

1.6.1.2 邻近杂交测序技术

1.6.2 芯片在突变和多态性检测和分析中的应用

1.6.3 基因芯片与大规模基因表达谱分析

1.6.4 基因芯片在疾病诊断中的应用

1.6.4.1.感染性疾病诊断

1.6.4.2.遗产性疾病的诊断

1.6.5 基因芯片技术在药物研究中的应用

1.6.5.1 遗传药理学与合理用药

1.6.5.2 基因芯片技术在疾病耐药性研究及检测方面的应用

1.6.5.3 基因芯片在微生物菌种鉴定及致病机制中的应用

1.7 参考文献

第二章 内质网压力反应

2.1 ER压力

2.1.1 蛋白质折叠原理

2.1.1.1.热动力学

2.1.1.2 动力学

2.2.1.3 蛋白质在ER中的折叠

2.1.1.4.蛋白质折叠器

2.1.1.5. ER压力分子伴侣的功能

2.1.1.6.非折叠蛋白的识别

2.2 内质网中非折叠蛋白的管理机制

2.2.1 转录诱导、翻译减弱和降解

2.2.2 UPR的时间控制：不同的感受器，不同的角色

2.2.3 正、负反馈环路

2.2.4 慎重的选择，是生存还是死亡

2.2.5 BoX_1 B细胞分化和UPR

2.2.6 在ER压力期间翻译控制是如何发生的?

2.3 内质网贮存性疾病

2.4 展望

2.5 参考文献

第三章 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对HeLa细胞基因表达谱的影响

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验方法

3.2.2.1 HCV NS4B重组真核表达质粒的构建

3.2.2.2.细胞培养和转染

3.3 结果

3.3.1.重组HCV NS4B真核表达质粒的构建

3.3.2.HCV NS4B蛋白基因在HeLa稳定细胞和Huh-7细胞中的表达

3.3.2.1 RT-PCR检测NS4B的mRNA

3.3.2.2 Western blot检测NS4B蛋白

3.3.3.点阵分析HCVNS4B对HeLa细胞信号调节的影响

3.3.3.1 微点阵系统的建立

3.3.3.2 表达差异的分析

3.3.3.3 对微点阵结果的验证

3.3.3.4.AKRICI酶活性的检测

3.4 讨论

3.5 参考文献

第四章 丙型肝炎病毒NS4B诱导细胞非折叠蛋白反应(UPR)

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验方法

4.2.2.1.质粒的构建

4.2.2.2.细胞培养和转染

4.2.2.3.Western Blot

4.2.2.4 XBPl的RT-PCR

4.2.2.5.ATF6和Grp78的Real-time定量RT-PCR

4.2.2.6.荧光素酶活性报告基因分析

4.2.2.7.染色质免疫沉淀实验(ChIP)

4.3 结果

4.3.1.NS4B的鉴定

4.3.2.XBPl的表达

4.3.3.NS4B诱导XBPl(s)的产生

4.3.4.荧光素酶的活性

4.3.5.染色质免疫沉淀

4.4 讨论

4.5 参考文献

博士研究生期间发表和待发表论文

致谢

发布时间: 2006-03-27

参考文献

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