德国进境马铃薯有害生物风险分析以及RT-PCR病毒检测技术的研究

论文摘要

马铃薯是世界性高产作物,我国的种植面积和产量居世界第一位,但其品质和单产水平确是远远落后于其他马铃薯生产先进的国家。我国急需从马铃薯生产先进的国家引进优质的马铃薯种薯来提高我国马铃薯的产量和品质。按照国际惯例,从境外引种前必须进行有害生物风险分析,以保护我国农业生产、生态安全。马铃薯病毒病是马铃薯生产中的重要制约因素,脱毒种薯的推广是控制马铃薯病毒的主要方法。引进种马铃薯种薯的质量鉴定和脱毒种薯的生产都要求建立快速,准确,灵敏的病毒检测方法。本研究通过德国进境马铃薯的有害生物风险分析对引种德国马铃薯进行了合理的风险预测,并确立了科学有效的风险管理措施,将引种风险降到最低;同时建立了同步检测多种马铃薯病毒的多重反转录聚合酶链式反应（M-RT-PCR）检测体系,为引种马铃薯质量的鉴定和脱毒种薯的生产提供快速、准确、灵敏、规范的病毒检测技术。1、德国进境马铃薯种薯的有害生物风险分析分为3个阶段（1）开始阶段:根据FAO制定的《有害生物风险分析准则》,从传播途径开始进行有害生物风险分析,确定德国进境马铃薯种薯上的有害生物共有179种。（2）风险评估:再根据有害生物的地理分布、经济重要性、种薯传带的可能性等综合指标进行初步评估,筛选出德国进境马铃薯种薯限定的有害生物（RP）和非限定有害生物（NRP）。对RP根据其传入、定殖、扩散的可能性以及潜在的影响进行详细的风险评估,确定德国进境马铃薯上潜在的检疫性有害生物（QP）21种和限定的非检疫性有害生物（RNQP）19种。（3）风险管理:根据风险分析中的相关风险因子制定出将引种风险降低到可接受水平的风险管理措施并对每种风险管理措施进行了效率评价。2、RT-PCR技术检测马铃薯病毒的研究（1） RT-PCR反应引物的设计:根据NCBI报道的病毒全基因组序列设计了PVA特异性引物对,根据病毒衣壳蛋白区序列设计了PVY和PLRV特异性引物对。采用单重、双重和多重RT-PCR对这3种马铃薯病毒进行了扩增,扩增片断大小分别为400bp（PVY）、300bp（PVY）和222bp（PLRV）。（2）马铃薯病毒RNA制备:采用了LiCl法、试剂盒法和浸提法3种方法提取马铃薯病毒RNA,结果表明LiCl法和试剂盒法提取的RNA经琼脂糖凝胶检测其纯度高且完整性较好,浸提法提取得的RNA其纯度和完整性不及其他两种方法,但3种方法提鹊腞NA均能符合RT-PCR的要求。（3） RT-PCR体系的建立:试验从反转录、PCR等方面对单重、双重和多重RT-PCR体系检测马铃薯种病毒进行了探索和优化。结果表明反转录反应中dNTPs浓度以及PCR反应中Mg2+浓度对RT-PCR体系检测PPVY、PVA和PLRV有较大的影响。优化后的多重RT-PCR反应体系可以同步检测这3种马铃薯病毒。（4）扩增产物的准确性验证:切胶回收PVY、PVA和PLRV扩增产物,分别克隆到PGM-T载体上,白色阳性菌落通过PCR验证表明PVY、PVA和PLRV的cDNA成功的转入了大肠杆菌中,提取质粒测序,经用NCBI BIAST比对,结果表明本研究进行的PVY、PVA和PLRV的RT-PCR扩增靶带的序列完全正确。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 有害生物风险分析研究现状
• 1.1.1 国外有害生物风险分析（PRA）研究现状
• 1.1.2 我国有害生物风险分析（PRA）的发展历程及现状
• 1.2 各国马铃薯生产现状
• 1.3 马铃薯病毒的研究现状
• 1.3.1 危害马铃薯的病毒种类
• 1.3.2 病毒导致马铃薯退化的原因及症状
• 1.3.3 马铃薯病毒病的防治方法
• 1.4 研究目的和意义
• 1.4.1 从德国引种马铃薯的目的及意义
• 1.4.2 德国进境马铃薯有害生物风险分析的目的及意义
• 1.4.3 马铃薯病毒检测技术研究的目的及意义
• 第二章 试验材料与方法
• 2.1 德国进境马铃薯PRA分析方法
• 2.1.1 开始阶段
• 2.1.2 评估阶段
• 2.1.3 风险管理阶段
• 2.2 RT-PCR检测PVY、PLRV、PVA的材料与方法
• 2.2.1 供试材料
• 2.2.2 马铃薯病毒ssRNA的提取
• 2.2.3 马铃薯病毒RT-PCR的检测
• 2.2.4 RT-PCR产物的克隆和测序
• 第三章 研究结果与分析
• 3.1 德国进境马铃薯有害生物风险分析
• 3.1.1 德国进境马铃薯上潜在有害生物的确定
• 3.1.2 限定的有害生物名单的确定
• 3.1.3 检疫性有害生物（QP）的确定及其风险评估
• 3.1.4 风险管理措施及其效率评价
• 3.2 马铃薯病毒的RT-PCR检测
• 3.2.1 供试材料的收集和保存
• 3.2.2 马铃薯病毒ssRNA的提取
• 3.2.3 马铃薯病毒RT-PCR检测
• 3.2.4 RT-PCR扩增产物的克隆和测序
• 第四章 讨论
• 4.1 有害生物风险分析
• 4.1.1 进境德国马铃薯种薯的QP和RNQP名单的科学性
• 4.1.2 风险分析中存在的问题
• 4.2 RT-PCR检测法和ELISA检测法比较
• 4.3 马铃薯病毒RNA的快速制备方法
• 4.4 双重或多重RT-PCR检测马铃薯病毒
• 4.4.1 反转录体系
• 4.4.2 PCR体系
• 4.5 RT-PCR产物的克隆和测序
• 第五章 创新与展望
• 参考文献
• 附录
• 附录1: QP的检疫风险评估资料
• 附录2: RT-PCR扩增产物的测序结果
• 附录3: 攻读硕士期间发表的学术论文与成果
• 致谢