Bacillus sonorensis BP-2产抗柑橘青霉病活性物质的发酵过程控制与优化

论文摘要

本论文借助摇瓶以及15-L的发酵罐,对Bacillus sonorensis BP-2产抗柑橘青霉病活性物质的发酵过程控制与优化进行了详细研究。首先通过摇瓶发酵,对Bacillus sonorensis BP-2的培养条件、种子培养基和发酵培养基等进行了优化。摇瓶培养条件的优化结果表明：30 mL/250-mL三角瓶的培养基装量、240rpm的摇床转速、6.0-8.0的初始培养基pH值以及5%的接种量,最有利于活性物质的合成。通过L9（43）正交实验设计,优化后的种子培养基配方确定为：葡萄糖50g/L、蛋白胨15g/L、（NH4）2SO413g/L、KH2PO42.0 g/L、MgSO43g/L、MnCl2lg/L。采用中心组合设计和响应面分析的方法,优化后的发酵培养基配方（gL）为：葡萄糖50、蛋白胨21.29、（NH4）2SO48.7、KH2PO42.0、MnCl21.0、MgSO43.0、NaC15.0。接下来对Bacillus sonorensis BP-2的摇瓶分批补料发酵模式进行了详细研究。考察了摇瓶分批补料发酵中的碳源补加策略,研究结果表明：在第48-96h将总糖浓度控制在2.0-2.5 g/100mL,可以很好地解决分批发酵模式因基质缺乏所致的菌体过早自溶及代谢能力下降的现象,放瓶时（第120h）的抗柑橘青霉病活性物质相对效价达到783.03 mg/L,比摇瓶分批发酵下的相对效价（476.48mg/L）提高了64.34%。在此基础上,考察了摇瓶分批补料发酵中的氮源补加策略,研究结果表明：NH4+的阶段性补加既可保证NH4+的供给,又可有效地降低发酵液中的NH4+浓度,从而在不降低菌体生长的情况下降低其对抗柑橘青霉病活性物质合成所产生的负作用。当发酵培养基的NH4+初始浓度为80 mmol/L时,另外在第24、28、32 h和36 h分别补加20 mmol/LNH4+,该方案下最终的菌体光密度值达到32.39,抗柑橘青霉病活性物质的相对效价达到980.2 mgL。最后对Bacillus sonorensis BP-2在15-L罐上的发酵工艺进行了优化。考察了Bacillus sonorensis BP-2分批补料发酵过程下的pH控制策略,结果表明：当发酵过程的pH值控制在6.80-7.00,其菌体干重和相对效价由分批发酵条件下的18.07gL和517.36 mg/L分别提高至31.85g/L和2142.18mg/L。考察了Bacillus sonorensis BP-2分批补料发酵过程的DO控制策略,结果表明：二阶段的DO控制策略（菌体快速生长阶段,即第0-60 h时DO控制在20%,此后DO控制转至10%）要明显优于10%和20%的单阶段DO控制方案,其放罐时抗柑橘青霉病活性物质的相对效价达到2357.72mg/L,较10%的单阶段DO控制时获得的相对效价（2142.18mg/L）增加了10.06%。考察了Bacillus sonorensis BP-2分批补料发酵过程的N源补加策略,结果表明：将发酵培养基中NH4+的用量由140 mmol/L降低至80 mmol/L,并在第18、24、30、36、42、48、54和60h分别补加10 mmol/L的NH4+,放罐时的菌体干重达32.95gL,抗柑橘青霉病活性物质的相对效价达2502.18mg/L。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 国内外柑橘生产概况
• 1.2 果蔬采后病害的发生及柑橘采后主要病害
• 1.2.1 果蔬采后病害的发生
• 1.2.2 柑橘采后主要病害
• 1.3 采后水果防腐保鲜的主要措施
• 1.3.1 低温贮藏
• 1.3.2 气调贮藏
• 1.3.3 采后热处理
• 1.3.4 辐照处理
• 1.3.5 化学保鲜
• 1.4 果蔬采后病害的生物防治
• 1.4.1 生物防治
• 1.4.1.1 生物防治的概念
• 1.4.1.2 生物防治的途径
• 1.4.2 拮抗菌防治果蔬采后病害的研究进展
• 1.4.2.1 拮抗菌的筛选途径
• 1.4.2.2 拮抗菌的抑病机理
• 1.4.2.3 拮抗菌的生防效果
• 1.5 提高拮抗菌抑菌效果的措施
• 1.5.1 使用多种拮抗菌混合制剂
• 1.5.2 与化学杀菌剂结合使用
• 1.5.3 添加特定的营养佐剂
• 1.5.4 与采后涂被措施结合
• 1.5.5 其它物质对拮抗效果的影响
• 1.6 微生物发酵工艺的研究
• 1.6.1 发酵培养基的组成与优化
• 1.6.2 分批补料发酵的调控策略
• 1.7 课题来源及意义
• 1.7.1 课题来源
• 1.7.2 研究目的和意义
• 1.7.3 本论文主要研究内容
• 第二章 Bacillus sonorensis BP-2摇瓶发酵条件的初步优化
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 主要试剂
• 2.2.1.2 主要仪器
• 2.2.2 菌种
• 2.2.3 培养基
• 2.2.3.1 斜面培养基
• 2.2.3.2 种子培养基
• 2.2.3.3 原始发酵培养基
• 2.2.4 方法
• 2.2.4.1 摇瓶培养方法
• 2.2.4.2 抗菌活性物质浓度的测定方法
• 2.2.4.3 统计分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 Bacillus sonorensis BP-2种子培养基的优化
• 2.3.2 Bacillus sonorensis BP-2摇瓶发酵条件的初步优化
• 2.3.2.1 摇瓶装样量的优化
• 2.3.2.2 摇瓶转速的优化
• 2.3.2.3 发酵培养基初始pH的优化
• 2.3.2.4 接种量的优化
• 2.3.3 Bacillus sonorensis BP-2发酵培养基的优化
• 2.3.3.1 部分因子析因设计
• 2.3.3.2 最陡爬坡实验设计
• 2.3.3.3 中心组合设计和响应面分析
• 2.4 本章小结
• 第三章 Bacillus sonorensis BP-2摇瓶分批补料发酵模式的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.1.1 主要试剂
• 3.2.1.2 主要仪器
• 3.2.2 菌种
• 3.2.3 培养基
• 3.2.3.1 斜面培养基
• 3.2.3.2 种子培养基
• 3.2.3.3 发酵培养基
• 3.2.4 方法
• 3.2.4.1 摇瓶分批补料发酵的研究方法
• 3.2.4.2 分析方法
• 3.2.4.2.1 菌体生物量测定
• 3.2.4.2.2 总糖测定
• 3.2.4.2.3 氨基氮测定
• +浓度的测定'>3.2.4.2.4 NH4⁺浓度的测定
• 3.2.4.2.5 pH的测定
• 3.2.4.2.6 抗柑橘青霉病活性物质相对效价的测定方法
• 3.2.4.3 统计分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 Bacillus sonorensis BP-2摇瓶分批发酵的代谢动态变化
• 3.3.2 Bacillus sonorensis BP-2摇瓶分批补料发酵的碳源补加策略
• 3.3.3 Bacillus sonorensis BP-2摇瓶分批补料发酵模式下的氮源补加策略
• 3.3.3.1 蛋白胨的补加对Bacillus sonorensis BP-2摇瓶分批补料发酵的影响
• +添加时间对Bacillus sonorensis BP-2摇瓶分批补料发酵的影响'>3.3.3.2 NH4⁺添加时间对Bacillus sonorensis BP-2摇瓶分批补料发酵的影响
• +补加浓度和补加模式对Bacillus sonorensis BP-2摇瓶分批补料发酵的影响'>3.3.3.3 NH4⁺补加浓度和补加模式对Bacillus sonorensis BP-2摇瓶分批补料发酵的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 Bacillus sonorensis BP-2在15-L罐上发酵工艺的优化
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要仪器
• 4.2.2 菌种
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 15-L罐发酵方法
• 4.2.5 分析方法
• 4.2.5.1 菌体生物量的测定方法
• 4.2.5.2 离线参数的测定方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 Bacillus sonorensis BP-2分批发酵过程基本特性
• 4.3.2 Bacillus sonorensis BP-2分批补料发酵过程的pH控制策略
• 4.3.3 Bacillus sonorensis BP-2分批补料发酵过程的DO控制策略
• 4.3.4 Bacillus sonorensis BP-2的二阶段DO控制策略
• 4.3.5 Bacillus sonorensis BP-2的N源补加策略
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.1.1 实现了Bacillus sonorensis BP-2种子培养基、发酵培养基和摇瓶发酵条件的优化
• 5.1.2 建立了Bacillus sonorensis BP-2摇瓶分批补料发酵的模式
• 5.1.3 优化了Bacillus sonorensis BP-2在15-L罐上的发酵工艺
• 5.2 论文创新点
• 5.3 展望
• 参考文献
• 致谢