论文摘要
本论文研究了中草药黄芪、王不留行对奶牛乳腺上皮细胞体外增殖和乳蛋白合成的影响,并对其具体机制作了初步探索。首先建立奶牛乳腺上皮细胞的体外培养体系,培养出具有正常生理功能的奶牛乳腺上皮细胞,并以该细胞系为模型,筛选对乳腺细胞体外生长有促增殖效应的中草药,确定其适宜的作用浓度和作用时间,在此基础上,进一步研究中草药王不留行、黄芪对乳腺细胞一系列生物活性的影响及其作用机理。本研究包括五个部分。1奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系的建立采用组织块培养法、联合应用差酶消化法和反复贴壁法建立体外奶牛乳腺上皮细胞培养体系,采用透射电镜、免疫组化、免疫印迹等试验技术方法对乳腺上皮细胞特性进行检测。试验结果表明,运用本方法建立的奶牛乳腺细胞系上皮特性及分泌功能特征完备。2七味中草药粗提液对奶牛乳腺上皮细胞促增殖作用的比较研究研究比较七味中草药对奶牛乳腺上皮细胞体外生长的促增殖效应。确定黄芪、王不留行、当归、川芎、栝楼、漏芦和续断粗提物为备筛药物,采用2-3代奶牛乳腺上皮细胞（CMEC）为试验材料,在细胞培养液中添加不同浓度的上述中草药提取液,采用MTT比色法,比较其对细胞增殖的促进作用。试验结果表明,与对照组相比,浓度分别为10 mg/mL的王不留行,20 mg/mL的黄芪,10 mg/mL+20 mg/mL的王不留行黄芪混合物均可极显著地促进乳腺上皮细胞生长（p<0.01）,尤以10 mg/mL+20mg/mL的王不留行黄芪配伍组作用效果最好。3王不留行与黄芪促进奶牛乳腺上皮细胞增殖调控机理的初步研究试验以2-3代奶牛乳腺上皮细胞（CMEC）为试验模型,采用流式细胞仪、免疫组织化学染色法,检测王不留行（10 mg/mL）、黄芪（20 mg/mL）、王不留行黄芪配伍（10 mg/mL+20 mg/mL）对乳腺上皮细胞增殖周期分布、ClycinD1、p27蛋白在乳腺上皮细胞内阳性表达的影响。试验结果表明,与对照组相比,浓度分别为10 mg/mL的王不留行,20 mg/mL的黄芪,10 mg/mL+20 mg/mL的王不留行黄芪配伍均可促进乳腺上皮细胞细胞周期G1/S期转换（p<0.01）,增加细胞周期中S期细胞的数目（p<0.01）,CyclinD1的阳性表达均得到上调（p<0.01）,p27的阳性表达均下降（p<0.01）,尤以王不留行黄芪配伍作用明显。结果提示,黄芪、王不留行促进乳腺细咆的增殖,是通过上调CyclinD1表达、下调p27表达水平,进而加速细胞周期G1/S期的转换完成的。4王不留行与黄芪对奶牛乳腺上皮细胞体外分泌性能的影响本试验研究了中草药黄芪、王不留行对奶牛乳腺上皮细胞体外分泌性能的影响。以2-3代奶牛乳腺上皮细胞（CMEC）为试验模型,研究中草药黄芪、王不留行作用前后细胞内部超微结构的变化、细胞裂解液中氨基酸总浓度及组分的变化规律,以及细胞裂解液中蛋白总浓度的变化。试验结果表明,与空白对照组相比,王不留行（10mg/mL）、黄芪（20 mg/mL）、王不留行与黄芪配伍（10 mg/mL+20 mg/mL）作用于细胞后,细胞内部超微结构发生了重塑,表现出更多功能分泌分化的特征标志;细胞裂解液中氨基酸的总浓度均得到提高（p<0.01）,细胞裂解液中游离氨基酸的总浓度均显著或极显著地提高（王不留行（10 mg/mL）、王不留行黄芪配伍（10 mg/mL+20mg/mL）,p<0.01;黄芪（20 mg/mL）,P<0.05;）;细胞裂解液中蛋白总含量亦有明显的增高,（王不留行（10 mg/mL）、王不留行黄芪配伍（10 mg/mL+20 mg/mL）,p<0.01;黄芪（20 mg/mL）,P>0.05;）。结果提示,中草药黄芪、王不留行可通过对乳腺细胞内部超微结构的重塑、促进乳腺细胞吸收胞外游离氨基酸,使乳腺细胞蛋白合成增多。5王不留行与黄芪对奶牛乳腺上皮细胞合成乳铁蛋白和酪蛋白的影响本试验以2-3代奶牛乳腺上皮细胞（CMEC）为试验模型,应用荧光定量RT-PCR技术研究了中草药王不留行、黄芪对乳腺细胞as1-酪蛋白、β-酪蛋白和乳铁蛋白基因表达的影响;应用ELISA竞争抑制性法检测,王不留行、黄芪作用前后乳腺细胞裂解液中as1-酪蛋白、β-酪蛋白和乳铁蛋白含量的变化。试验结果表明,与空白对照组相比,王不留行黄芪配伍（10 mg/mL+20 mg/mL）、王不留行（10 mg/mL）均极显著提高as1-酪蛋白mRNA的表达（p<0.01）,黄芪（20 mg/mL）组细胞as1-酪蛋白mRNA表达稍低于空白对照组,差异不显著（P>0.05）;王不留行黄芪配伍（10 mg/mL+20mg/mL）、王不留行（10 mg/mL）均显著提高β-酪蛋白mRNA的表达（p<0.05）,黄芪（20 mg/mL）组细胞β-酪蛋白mRNA表达稍高于空白对照组,差异不显著（P>0.05）;王不留行黄芪配伍（10 mg/mL+20 mg/mL）显著提高乳铁蛋白mRNA的表达（p<0.05）,王不留行（10 mg/mL）组和黄芪（20 mg/mL）组细胞乳铁蛋白mRNA的表达稍高于空白对照组,差异不显著（P>0.05）。as1-酪蛋白合成量的检测结果表明,黄芪（20mg/mL）+王不留行（10 mg/mL）配伍作用效果较明显,其组内乳腺细胞as1-酪蛋白合成量显著高于空白对照（P<0.05）;而黄芪（20 mg/mL）组和王不留行（10 mg/mL）组相比较于空白对照组,组内乳腺细胞as1-酪蛋白合成量略有增高,差异不显著（P>0.05）。β-酪蛋白合成量的检测结果表明,黄芪（20 mg/mL）+王不留行（10 mg/mL）配伍组和王不留行（10 mg/mL）组细胞β-酪蛋白合成量显著高于空白对照组（P<0.05）,黄芪（20 mg/mL）组细胞β-酪蛋白合成量略高于空白对照组,但差异不显著（P>0.05）。乳铁蛋白合成量的检测结果表明,与空白对照组比较,中草药作用细胞后,乳腺细胞乳铁蛋白合成量均略有增高,但差异不显著（P>0.05）。以上五个试验部分的研究结果表明:中草药黄芪、王不留行促进乳腺细胞as1-酪蛋白、β-酪蛋白和乳铁蛋白的合成,其潜在机制与其能够促进乳腺上皮细胞增殖、促进乳腺上皮细胞内部超微结构重塑、促进乳腺上皮细胞吸收胞外游离氨基酸密切相关。