微生物制备γ-聚谷氨酸的研究

论文摘要

聚-γ-谷氨酸是一种由D-谷氨酸和L-谷氨酸为单体以γ-羧基与α-氨基以肽键的形式缩合而成的一种聚阴离子类多肽分子,在医药、食品和农业等领域具有广泛的应用前景。 本论文采用枯草芽孢杆菌发酵制备聚γ-谷氨酸。从出发菌株筛选鉴定高产菌株,通过对摇瓶培养条件和发酵罐培养条件优化提高了聚γ-谷氨酸的产量,建立了发酵动力学模型,并开发了产物分离纯化的整套工艺。在此基础上,研究了枯草芽孢杆菌与谷氨酸棒杆菌混合培养的新工艺和采用味精生产的中间产物作为谷氨酸前体等方法降低聚γ-谷氨酸生产成本。同时,通过PCR的方法,将克隆得到的pgsBCA基因在大肠杆菌JM109中进行表达,最终得到了具有聚γ-谷氨酸生产能力的重组菌E.coli JM109/pTrc99a- pgsBCA。 从自然界筛选得到了一株聚γ-谷氨酸高产菌株,通过16s rDNA测序后BLAST以及生理生化性质,确定该菌株为枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis ZJU-7,保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCC No.1250。 进行了Bacillus subtilis ZJU-7的培养条件优化及放大工作。通过对摇瓶的培养条件优化,得到了如下优化的培养基成分为:蔗糖59.80g/L,蛋白胨53.54g/L,,L-谷氨酸81.05g/L,NaCl 10g/L,MgSO4·7H2O 1.0g/L,CaCl2 1.0g/L;优化的培养条件为:培养温度,37℃,摇床转速,200rpm。在上述条件下,经过24～32小时发酵,最终聚γ-谷氨酸的产量为58.3g/L。在此基础上,将培养体系由摇瓶放大到5升发酵罐,聚γ-谷氨酸产量达到了51.7g/L。 开展了将谷氨酸棒杆菌发酵生产谷氨酸和枯草芽孢杆菌聚合生产聚γ-谷氨酸耦联发酵的研究。对影响混合培养的因素如种龄、混合比例、温度、溶氧等进行了优化,在优化的培养条件下,不需添加L-谷氨酸,聚γ-谷氨酸的产量达到了32.8g/L。 采用三种味精生产的中间产物作为谷氨酸替代前体,研究了蔗糖、胰蛋白胨和谷氨酸含量对聚γ-谷氨酸产量的影响。在优化后培养基中进行发酵生产,最终聚γ-谷氨酸酸产量为52g/L。 从Bacillus subtilis ZJU-7中克隆得到了pgsBCA基因,构建了表达载体pTrc99a-pgsBCA,并在大肠杆菌JM109进行表达,最终得到了具有聚γ-谷氨酸生产能力的重组菌E.coli JM109/pTrc99a-pgsBCA。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 均聚氨基酸简介
• 1.2 γ-PGA的理化性质和应用研究
• 1.2.1 γ-PGA的理化性质
• 1.2.2 γ-PGA的应用
• 1.2.2.1 γ-PGA在医药领域的应用
• 1.2.2.2 γ-PGA在工业领域的应用
• 1.3 γ-PGA合成方法
• 1.3.1 化学合成法
• 1.3.2 提取法制备γ-PGA
• 1.3.3 酶转化法
• 1.3.4 微生物发酵法
• 1.4 微生物中γ-PGA的生物合成途径及其代谢调控
• 1.4.1 γ-PGA的生物合成途径
• 1.4.2 γ-PGA合成酶的基因研究
• 1.5 微生物发酵法生产γ-PGA的影响因素的研究
• 1.5.1 外源性L-谷氨酸对γ-PGA生产的影响
• 1.5.2 碳源对γ-PGA发酵产率的影响
• 1.5.3 氮源对γ-PGA生产的影响
• 1.5.4 金属离子对γ-PGA发酵生产的影响
• 1.5.5 pH和供氧对γ-PGA发酵生产的影响
• 1.5.6 γ-PGA分子量的控制
• 1.6 发酵液中γ-PGA的分离纯化
• 1.7 本论文的主要研究内容
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 菌种与质粒
• 2.2 仪器与试剂
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 主要试剂及标准品
• 2.2.3 工具酶及试剂盒
• 2.3 培养基和培养条件
• 2.3.1 主要培养基
• 2.3.2 培养方法
• 2.4 分析测定方法
• 2.4.1 pH测定
• 2.4.2 含菌量测定
• 2.4.3 γ-PGA的提取
• 2.4.4 γ-PGA的盐酸水解
• 2.4.5 γ-PGA的加热水解
• 2.4.6 γ-PGA的分子量测定方法
• 2.4.7 γ-PGA测定方法
• 2.4.7.1 酸水解法
• 2.4.7.2 直接测定法
• 2.4.7.3 HPCE测定法
• 2.4.8 谷氨酸含量测定方法
• 2.4.9 还原糖浓度测定
• 2.4.10 蔗糖含量测定方法
• 2.4.11 分子克隆相关实验
• 2.4.12 Bacillus subtilis ZJU-7基因组的提取
• 2.4.13 大肠杆菌细胞超声破碎及胞内蛋白提取
• 2.4.14 SDS-PAGE电泳
• 第三章 γ-PGA生产菌株的筛选和鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 分离菌种材料
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 培养条件
• 3.2.3.1 γ-PGA生产菌株筛选
• 3.2.3.1 菌种活化
• 3.2.3.2 芽孢制备
• 3.2.3.4 种子培养
• 3.2.3.5 摇瓶培养
• 3.2.4 产物鉴定
• 3.2.4.1 产物分离纯化
• 3.2.4.2 γ-PGA酸水解鉴定
• 3.2.4.2 γ-PGA分子量的测定
• 3.2.5 γ-PGA生产菌株的鉴定
• 3.2.5.1 16s rDNA序列测定
• 3.2.5.1.1 细菌总DNA提取
• 3.2.5.1.2 16s rDNA的PCR扩增
• 3.2.5.1.3 16s rDNA经PCR扩增产物的连接与转化
• 3.2.5.1.4 质粒转化子的提取和鉴定
• 3.2.5.2 其他生理生化性质测定
• 3.2.6 γ-PGA生产菌株的初步培养
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 γ-PGA生产菌株的筛选
• 3.3.2 产物鉴定
• 3.3.2.1 产物酸水解鉴定
• 3.3.2.2 样品分子量测定
• 3.3.2.3 样品其他性质测定
• 3.3.3 γ-PGA生产菌株的分类学鉴定
• 3.3.3.1 γ-PGA生产菌株16s rDNA测定
• 3.3.3.2 Bacillus subtillis ZJU-7其他生理生化特征
• 3.4 小结
• 第四章 Bacillus subtilis ZJU-7培养条件优化
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基和培养条件
• 4.2.2.1 培养基
• 4.2.2.2 培养方法
• 4.2.3 Bacillus subtillis ZJU-7生长曲线测定
• 4.2.4 培养条件优化
• 4.2.4.1 单因素培养条件优化
• 4.2.4.2 响应面培养条件优化（RSM）
• 4.2.4.2.1 部分析因设计（Fractional factorial design，FFD）
• 4.2.4.2.2 中心组合实验
• 4.2.5 分析测定方法
• 4.2.5.1 pH测定
• 600及生物量测定'>4.2.5.2 菌体OD₆₀₀及生物量测定
• 4.2.5.3 γ-PGA的测定
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 Bacillus subtillis ZJU-7生长曲线
• 4.3.2 单因素培养条件优化
• 4.3.2.1 碳源种类对γ-PGA产量的影响
• 4.3.2.2 碳源浓度对γ-PGA产量的影响
• 4.3.2.3 氮源种类对γ-PGA产量的影响
• 4.3.2.4 氮源浓度对γ-PGA产量的影响
• 4.3.2.5 谷氨酸前体对γ-PGA产量的影响
• 4.3.2.6 NaCl对γ-PGA产量的影响
• 4.3.2.7 温度对γ-PGA产量的影响
• 4.3.2.8 摇床转速对γ-PGA产量的影响
• 4.3.2.9 摇瓶装液量对γ-PGA产量的影响
• 4.3.3 响应面法（RSM）优化γ-PGA培养条件
• 4.3.3.1 部分析因实验设计
• 4.3.3.2 最陡爬坡实验
• 4.3.3.3 中心组合实验（CCD）
• 4.3.3.4 γ-PGA发酵培养过程
• 4.4 小结
• 第五章 Bacillus subtilis ZJU-7分批发酵研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株
• 5.2.2 培养基
• 5.2.3 培养方法
• 5.2.4 测定方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 pH对发酵过程的影响
• 5.3.1.1 未控制pH的发酵过程
• 5.3.1.2 控制pH对发酵过程的影响
• 5.3.2 温度对发酵过程的影响
• 5.3.3 搅拌转速对发酵过程的影响
• 5.3.4 通气量对发酵过程的影响
• 5.3.4 Bacillus subtilis ZJU-7分批发酵过程
• 5.3.5 Bacillus subtilis ZJU-7发酵生产γ-PGA动力学模型
• 5.3.5.1 菌体生长积累与γ-PGA的生长特性
• 5.3.5.2 动力学模型的建立
• 5.3.5.2.1 菌体生长动力学模型
• 5.3.5.2.2 产物生成动力学模型
• 5.3.5.2.3 底物消耗动力学模型
• 5.3.5.3 动力学参数求解
• 5.3.5.3 模型拟合分析
• 5.4 小结
• 第六章 利用不同来源谷氨酸生产γ-聚谷氨酸
• 6.1 前言
• 6.2 实验材料与方法
• 6.2.1 菌株
• 6.2.2 仪器与试剂
• 6.2.3 培养基
• 6.2.4 Corynebacterium glutamicum S9114培养过程
• 6.2.5 Bacillus subtilis ZJU-7发酵过程
• 6.2.6 混合培养过程
• 6.2.7 分析与测定
• 6.2.7.1 发酵液中谷氨酸浓度的测定
• 6.2.7.2 γ-PGA浓度的测定
• 6.2.7.3 菌体生物量的测定
• 6.2.7.4 谷氨酸棒杆菌发酵液中葡萄糖测定
• 6.2.7.5 Bacillus subtilis ZJU-7发酵液中蔗糖含量测定
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 Corynebacterium glutamicum S9114发酵过程
• 6.3.2 Bacillus subtilis ZJU-7发酵过程
• 6.3.3 混合培养条件优化
• 6.3.3.1 种龄对混合培养体系的影响
• 6.3.3.1.1 Corynebacterium glutamicum S9114种龄的影响
• 6.3.3.1.2 Bacillus subtilis ZJU-7种龄的影响
• 6.3.3.2 Bacillus subtilis ZJU-7加入量对混合培养体系的影响
• 6.3.3.3 培养基对混合培养体系的影响
• 6.3.3.4 温度对混合培养体系的影响
• 6.3.3.5 溶氧对混合培养体系的影响
• 6.3.3.6 混合培养过程
• 6.3.4 利用谷氨酸发酵生产中间产物生产γ-PGA
• 6.3.4.1 谷氨酸棒杆菌发酵液中残糖的测定
• 6.3.4.2 胰蛋白胨对不同谷氨酸替代前体生产γ-PGA的影响
• 6.3.4.3 蔗糖对不同谷氨酸替代物生产γ-PGA的影响
• 6.3.4.4 谷氨酸含量对于味精替代品生产γ-PGA的影响
• 6.3.4.5 以谷氨酸发酵液为谷氨酸替代前体发酵过程
• 6.4 小结
• 第七章 pgsBCA基因在大肠杆菌中的表达
• 7.1 前言
• 7.2 材料与方法
• 7.2.1 菌株、质粒及引物
• 7.2.2 培养基
• 7.2.3 工具酶和试剂盒
• 7.2.4 实验方法
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 PCR扩增及测序结果
• 7.3.1.1 PCR扩增结果
• 7.3.1.2 pgsB、pgsC、pgsA连接测序结果
• 7.3.2 pgsB、pgsC、pgsA连接与转化
• 7.3.3 重组质粒在大肠杆菌JM109中的表达
• 7.3.3.1 pTrc99a-pgsBCA的转化
• 7.3.3.2 pgsBCA在E.coli JM109／pTrc99a-pgsBCA中的表达
• 7.3.3.3 表达产物鉴定
• 7.4 小结
• 结论与展望
• 主要结论
• 展望
• 致谢
• 攻读博士学位期间科研成果