人甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白的原核表达及纯化

论文摘要

目的表达并纯化人甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白,为后期的拮抗NS1蛋白的短肽筛选工作奠定基础。方法（1）用RT-PCR法从人甲型流感病毒株A/PR/8/34/（H1N1）中扩增NS1基因,克隆入原核表达载体pTXB1,构建重组原核表达质粒pTXB1/NS1,经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21（DE3）,进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析NS1蛋白表达形式和表达量。（2）将1.0 mmol/L IPTG加入到重组表达载体pTXB1/NS1中,分别在26℃、28℃、30℃、32℃、35℃和37℃诱导表达4 h;在最佳诱导温度下,分别诱导4 h、8 h和12 h,寻求最佳的表达时间。（3）用几丁质柱亲和层析纯化表达蛋白,12% SDS-PAGE电泳对纯化的NS1蛋白进行鉴定,最后用串联飞行时间质谱仪检测NS1蛋白相对分子质量。结果所构建的重组表达质粒pTXB1/NS1序列完整,插入的基因片段全长690 bp。以1.0 mmol/L IPTG、37℃诱导4 h,重组蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的50%以上,破菌上清及沉淀中均有目的蛋白表达。纯化的NS1蛋白纯度达95 %以上,相对分子质量为26 340,与预期大小相符。结论（1）本试验成功表达A/PR/8/34/（H1N1） NS1蛋白。（2）经几丁质柱亲和层析纯化得到NS1蛋白。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 流感病毒的分子结构
• 1.2 流感病毒的复制过程
• 1.3 流感的流行状况
• 1.3.1 甲、乙、丙型流感的流行情况
• 1.3.2 流感病毒抗原性的变异
• 1.3.3 20 世纪四次流感大流行
• 1.4 流感病毒的理化特性
• 1.4.1 对热的稳定性
• 1.4.2 对pH 的稳定性
• 1.4.3 对紫外线的稳定性
• 1.4.4 对化学物的稳定性
• 1.5 甲型流感病毒NS1 蛋白结构及功能
• 1.5.1 NS1 蛋白抑制宿主细胞蛋白合成
• 1.5.2 NS1 蛋白应用于动物鉴别诊断
• 1.5.3 NS1 蛋白拮抗干扰素的作用
• 1.5.4 NS1 蛋白下调细胞凋亡
• 1.6 抗流感药物的研究进展
• 1.6.1 流感疫苗的研究概况
• 1.6.2 抗流感化学药物研究概况
• 第二章 人甲型流感病毒H1N1 亚型NS1 蛋白的原核表达
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 流感病毒A/PR/8/34（H1N1）总RNA 的鉴定
• 2.2.2 流感病毒A/PR/8/34（H1N1）NS1 基因的PCR 扩增产物鉴定
• 2.2.3 重组克隆质粒的鉴定
• 2.2.4 重组表达质粒的鉴定
• 2.2.5 表达产物的分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 A/PR/8/34（H1N1） NS1 基因的生物学特性
• 2.3.2 A/PR/8/34（H1N1） NS1 蛋白诱导表达
• 2.3.3 表达载体pTXB1的选择
• 2.3.4 A/PR/8/34（H1N1） NS1 基因的克隆
• 2.4 小结
• 第三章 pTXB1/NS1 融合蛋白的纯化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 表达产物的纯化
• 3.2.2 NS1 蛋白相对分子量的检测
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录一
• 致谢
• 作者简介