肝脏特异性表达人遗传印记基因PEG10转基因小鼠肝癌模型的建立

论文摘要

目的原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是一种全球性高度恶性肿瘤，发病率、死亡率居高不下，严重影响人类健康。早期发现和切除肿瘤是提高肝癌患者长期生存率的重要因素。肝癌的发生是多病因、多基因、多阶段的复杂过程。导致发病的危险因素主要有：病毒感染、肝硬化、黄曲霉素、化学致癌物及寄生虫感染，过量摄入酒精等。目前认为，肝癌的发病机制与癌基因的激活，抑癌基因和DNA修复基因的失活有关。其中肿瘤相关基因启动子区域CpG岛的甲基化、印记缺失等表观遗传学改变在癌变中发挥重要作用。但是导致肝癌发病和进展的具体分子机制尚不清楚，影响了肝癌的早期临床诊断。大多数肝癌患者在发现症状时，已届病程的中晚期阶段，伴有不同程度的肝内、肝外转移，错过了手术治疗的最佳时机。寻找肝癌发病相关的特异性分子靶是早期诊断肝癌，特别是甲胎蛋白水平正常的肝癌和小肝癌迫切需要解决的问题。PEG10（paternally expressed gene 10）是一个父方表达／母方印记的遗传印记基因（genetic imprinting gene）。有研究表明：PEG10基因在大多数肝癌组织、血清甲胎蛋白水平正常的肝癌和小肝癌中有高表达；处于G2／M期的小鼠再生肝脏组织中也检测到PEG10的表达。这些结果提示我们：PEG10在肝脏再生和人肝细胞肿瘤发生中起着重要作用，阐明PEG10异常表达的分子基础有助于了解肝脏疾病的发病机制。白蛋白是肝脏表达的血清蛋白，由分化成熟的肝细胞合成，其他组织细胞中的白蛋白基因处于关闭状态。白蛋白基因（albumin gene，ALB）启动子序列（ALBpromoter，AGP）因高度保守性和包含的肝脏特异性表达元件，使组织特异性表达成为可能。自1989年Izban克隆了小鼠AGP序列，其在转基因动物及基因治疗中得到了广泛的应用，实现了基因转移的器官靶向性。本课题借助分子生物学方法构建包含有AGP和PEG10基因片段的转基因载体，制备肝脏特异性表达PEG10的转基因小鼠。采用酒精灌胃的方法处理各组小鼠，观察PEG10基因过表达是否会诱发其产生肝癌，增强罹患肿瘤的易感性。进一步探讨PEG10基因的生物学功能以及其作为肝癌基因治疗新靶点的可能性。方法提取人肝癌细胞HepG2总RNA，用RT-PCR方法获得PEG10基因全长DNA片段，与Simple T载体连接。经过酶切、测序鉴定后将PEG10插入到含有CMV启动子的真核表达载体pEGFP-N1中，构建重组质粒pEGFP-PEG10。pEGFP-PEG10转染L02细胞，经G418抗性筛选，挑选阳性克隆并扩大培养，阳性细胞命名为L02／PEG10，未转染任何质粒的正常L02细胞和转染空载体pEGFP-N1的L02细胞（L02／vector）为阴性对照组细胞，以表达内源性PEG10基因的HepG2细胞为阳性对照细胞。RT-PCR法检测各组细胞中PEG10 mRNA的表达水平，Western Blot及免疫细胞化学法检测PEG10蛋白的表达和亚细胞定位。用50-400mM H2O2分别处理L02／PEG10、正常L02细胞和L02／vector 6h、1 2h、24h后，进行hoechst33342染色。荧光显微镜观察细胞核的变化并抽提DNA进行琼脂糖凝胶电泳。提取小鼠外周血基因组DNA，用PCR方法获得AGP片段，与T载体连接。经过酶切、测序鉴定后将AGP片段插入到无启动子的真核表达载体pEGFP-1中，构建重组质粒pAGP-EGFP。pAGP-EGFP分别瞬时转染L02细胞、人宫颈癌细胞Hela、人结肠癌细胞SW480和人胰腺癌细胞Bxpc-3。pEGFP-1和pEGFP-N1分别为阴性对照和阳性对照质粒，转染上述四种细胞。瞬时转染24h、48h、72h、96h后，倒置荧光显微镜观察各组细胞中AGP启动EGFP表达的能力；瞬时转染72h后，流式细胞仪定量分析各组细胞EGFP的相对荧光强度。同时筛选出稳定转染pAGP-EGFP和pEGFP-N1的L02细胞株，流式定量分析AGP转录活性与CMV转录活性的差别。最后将PEG10基因片段连接到AGP的下游，构建转基因载体pAGP-PEG10-EGFP，将pAGP-EGFP作为转基因对照质粒。pAGP-PEG10-EGFP经BamH I、Age I双酶切，pAGP-EGFP经Xba I单酶切后，分别胶回收具有表达功能的线性化元件，经纯化和定量后，采用显微注射法导入小鼠受精卵雄原核，移植入假孕母鼠输卵管内，待其产仔。提取G0代小鼠鼠尾组织DNA，PCR检测目的基因在转基因小鼠中的整合阳性率。观察转基因阳性鼠的皮毛、饮食、精神、活动度等一般情况。若在饲养过程中出现小鼠死亡，则提取其心、肺、肾、胃、小肠、肝脏、脾脏、子宫、卵巢组织总RNA和总蛋白，RT-PCR和Western Blot检测PEG10mRNA和蛋白在上述组织中的表达。HE染色观察肝脏有无病理改变。分别取PEG10转基因阳性鼠、转基因对照鼠和野生型小鼠，给予小剂量酒精（0．3g／kg）灌胃，每天两次。期间观察各组小鼠的一般情况。6个月后，各组动物恢复至正常饲养条件。两个月后处死小鼠，取肝脏组织称重，进行HE染色，检测PEG10转基因小鼠是否产生肝癌。结果琼脂糖凝胶电泳、酶切及测序结果表明PEG10基因片段扩增无误，并按正确的顺序插入到Simple T载体中。RT-PCR和Western Blot结果显示：PEG10基因在L02／PEG10中顺利实现表达。免疫细胞化学显示：PEG10蛋白主要分布在胞浆中，部分在核膜中表达。经400mM H2O2作用24h后，正常L02细胞和L02／vector可见凋亡特有的改变，如胞浆和核固缩、染色质断裂、DNA电泳呈梯状条带，而L02／PEG10未发现上述凋亡特征。酶切与测序鉴定显示：AGP片段完整正确地插入到T载体中。在pEGFP-N1瞬时转染各组细胞的不同时段，荧光显微镜下都能观察到EGFP的高表达：pAGP-EGFP瞬时转染L02细胞72h后，荧光显微镜下观察到EGFP的表达，流式分析显示：AGP启动EGFP表达的相对荧光强度为CMV的1／4，其它转染细胞观察不到EGFP的表达。转染pAGP-EGFP的L02经G418稳定筛选2w后，AGP的转录活性达到与CMV相当的水平。胶回收AGP-PEG10转基因片段后，将其显微注射导入1656枚受精卵中，产仔162只，PCR检测阳性鼠1 3只，转基因整合阳性率为8％。转基因对照小鼠的制备共注射受精卵1782枚，产仔151只，有12只小鼠经PCR检测证实为EGFP基因整合阳性鼠，整合阳性率为7．9％。在饲养过程中，有一只PEG10转基因小鼠死亡，RT-PCR和Western Blot检测到其肝脏内PEG10 mRNA和蛋白的表达，HE染色提示该小鼠的肝脏呈肝细胞癌病理学表现，出现大量异形核细胞，核大深染。其他存活转基因阳性鼠生长状态良好。酒精灌胃结束后，有两只PEG10转基因小鼠死亡，肝脏组织HE染色显示呈肝细胞癌病理表现。剩余10只PEG10转基因小鼠逐渐出现精神欠佳、进食进水量减少、活动减少、行动迟缓、皮毛失去光泽、身体消瘦、疲乏无力的表现。对照组小鼠一般情况正常。处死小鼠后，转基因对照组小鼠和野生型小鼠的肝脏重量分别为（3．98±0．94）g和（3．54±0．72）g，均显著低于PEG10转基因小鼠（8．29±0．76）g，P＜0．05。HE染色结果提示对照组小鼠的肝细胞排列完整致密，细胞间质成分正常。PEG10转基因小鼠中有6只小鼠的肝脏细胞核深染呈蓝色，大小不等，异形性明显，呈低分化癌，其他四只PEG10小鼠的肝细胞周围和小叶中央下静脉周围可见纤维化。结论PEG10基因可抑制H2O2诱导的细胞凋亡，低浓度酒精灌胃处理小鼠6个月后，PEG10的过表达可增强试验动物罹患肝癌的易感性，诱发其产生肝癌。本研究一定程度上为PEG10作为肝癌基因诊断和治疗一个新的分子靶点提供了实验依据。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 PEG10真核表达载体的构建及其对H2O2诱导的L02细胞凋亡的影响
• 1 材料及方法
• 2 统计学分析
• 3 结果
• 讨论
• 第二部分 小鼠白蛋白基因启动子的克隆及组织特异性检测
• 1 材料及方法
• 2 统计学分析
• 3 结果
• 讨论
• 第三部分 肝脏特异性表达PEG10转基因小鼠肝癌模型的建立
• 1 材料及方法
• 2 统计学分析
• 3 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 参考文献
• 附录1:实验中所使用的主要仪器和配置的试剂
• 附录2:攻读期间发表的论文与获奖情况
• 致谢