水飞蓟宾纳米晶释药系统的构建与评价

论文摘要

难溶性化合物的制剂研究是新药研发的重要难题,是导致研发高失败率、高风险和高投入的关键原因,也是降低药物临床疗效、增加临床不良反应发生率、加重医疗费用的重要因素。纳米晶是近十几年兴起并逐步应用于工业化生产的药物制剂新技术,具有小尺寸效应和量子隧道效应,其首要特征是提高难溶性药物的溶解度和溶出速率,以及由此派生出的其它诸多理化性质和生理特性。水飞蓟宾是一种具有低毒高效保肝特性的难溶性黄酮木脂素类化合物,是水飞蓟的主要活性成分。现上市剂型为片剂和胶囊剂,Beagle犬口服生物利用度约为17%,因其水溶性差而导致低生物利用度严重影响了临床疗效。本论文将以纳米晶为改善难溶性药物功效的关键技术、以水飞蓟宾为模型药物,进行其纳米晶释药系统的构建与评价。本课题主要目的是通过活塞-缝隙式高压均质法构建可供口服和注射给药的两种水飞蓟宾纳米晶制剂,建立水飞蓟宾体内外分析方法,考察其药剂学特性和体内药物动力学及组织分布特征,研究其跨膜转运特性,并通过体内外急性肝损伤模型评价水飞蓟宾纳米晶的药效学特征。本研究的主要内容包括处方前研究、纳米晶工艺筛选与处方研究、冷冻干燥工艺研究与保护剂筛选、HPLC-MS建立生物样品分析方法、Beagle犬口服和静脉滴注纳米晶药动学研究、小鼠尾静脉注射纳米晶组织分布研究、体外Caco-2细胞跨膜转运研究、体外HL7702肝细胞和体内Beagle犬急性肝损伤模型药效学研究等。采用HPLC-DAD建立了体外样品中水飞蓟宾的分析方法,方法学考察符合要求。处方前研究结果表明,水飞蓟宾的溶解度随溶剂的pH值的递增而增大,pH7.4的PBS中的溶解度为49.7μg·ml-1,正辛醇-水中油水分配系数1gP约为2.8（1gP<5）,提示水飞蓟宾低溶解度所导致的较慢的溶出速率可能是致使水飞蓟宾口服生物利用度低的主要原因。制备工艺与处方筛选结果表明,活塞-缝隙式高压均质法制备水飞蓟宾纳米晶具有良好的重现性和稳定性,适合其纳米晶的制备,纳米晶粒径随均质压力的增大而逐步减小,其1800 bar时粒径约为800 bar时的1/5；随均质次数的增多,纳米晶粒度分布逐步趋于均一,且以最终压力下均质15次为佳。采用L9（34）正交设计法进行纳米晶处方筛选,以不同浓度的磷脂、泊洛沙姆F68.SDS和PVPK30为筛选对象,以Zeta-电位为考察指标,分析结果表明以0.2%磷脂,0.1%泊洛沙姆F68,0.05％SDS,0.05％PVP K30为处方时纳米晶的Zeta-电位最大,经其安全性和稳定性因素考虑,最终确定处方组成为：每100 ml注射用水中含0.5g水飞蓟宾、0.2 g磷脂和0.1 g泊洛沙姆F68。为进一步提高水飞蓟宾纳米晶的稳定性,对包括甘露醇、海藻糖、p-环糊精、乳糖、葡萄糖及右旋糖酐等在内的多种多元醇和高分子化合物进行真空冷冻干燥保护剂筛选,以冻干品外观形态、纳米晶与保护剂结合形式等为考察因素,并最终确定5%（w/v）甘露醇为最佳保护剂,冻干品外观为完整的圆饼状,表面平滑,质地轻柔,显微观察表明在冻干过程中甘露醇充分的代替了水-OH作用,与纳米晶交替形成有序网状结构,阻止了纳米晶的相互接触和熟化,并起到支架剂作用；冻干工艺考察表明,以-80℃预冻24 h、真空冻干48 h为宜,冻干品含水量低于3%。为考察水飞蓟宾纳米晶口服和注射给药的可行性,制备粒径不同大小的纳米晶SN-A和SN-B:800 bar下均质15次并按照冻干工艺干燥,得纳米晶SN-A；1800bar下均质15次并按照冻干工艺干燥,得纳米晶SN-B；并分别对SN-A和SN-B进行物相分析和表征。SN-A的粒径及Zeta..电位分别为641.8±14.7 nm（PI-0.375）和-23.1±0.6 mV,SN-B的粒径及Zeta.电位分别为127±1.9 nm（PI-0.292）和-25.5±0.7 mV；TEM观察表明SN-A和SN-B中纳米晶基本呈完整球形外观,粒径与激光粒度分布仪所测结果基本相符,且粒度分布较为均一；AFM扫描表明SN-A与SN-B的形态间存在一定差异,且可见稳定剂在纳米晶表面形成的保护膜；冻干品SEM观察显示,纳米晶粒度分布均匀,SN-B的粒径小于SN-A,两者外观均呈不规则的颗粒状；DSC法和XRPD法分析纳米晶中水飞蓟宾晶型,结果表明,高压均质过程和冷冻干燥操作未引起水飞蓟宾晶态的转化；pH6.0和pH7.4的PBS中的纳米晶溶出速率考察表明,纳米晶可提高水飞蓟宾溶出速率,且SN-B溶出速率大于SN-A; pH6.0的PBS中,纳米晶可将水飞蓟宾的饱和溶解度提高约2.2倍；SN-A和SN-B的比表面积分别为0.435 m2.g-1和0.484 m2·g-1,SN-A孔隙率为0.00401m1·g-1,孔径为17.05±16.0 nm,SN-B孔隙率为0.00431 ml·g’,孔径为17.03±16.4nm；稳定性加速实验考察表明SN-A和SN-B在6个月内具有良好的稳定性。采用HPLC-MS建立了犬血浆等生物样品中水飞蓟宾含量检测的分析方法,方法学考察符合《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》要求。Beagle犬口服给药水飞蓟宾原料药或纳米晶（SN-A, SN-B） 20 mg-kg"1后经DAS2.0药动学程序计算,均符合二室模型。纳米晶SN-A和SN-B生物利用度分别为原料药组的2.3倍和2.9倍；SN-A和SN-B的Cmax高于原料药组；原料药组的MRT值最小,SN-A的较长,而SN-B的为最长；原料药组、SN-A和SN-B的tmax值分别为0.56 h、1.03 h和1.08 h。Beagle犬静脉滴注给药水飞蓟宾溶液或纳米晶（SN-A, SN-B） 15 mg·kg-1后经DAS2.0药动学程序计算,溶液组和SN-B组符合三室模型,SN-A组符合二室模型。与溶液组相比,纳米晶可延长tt/2并增大AUC,尽管溶液组Cmax最高,但清除率高,其MRT较短。该实验表明,对于低溶出速率和体内药动学参数欠佳的水难溶性药物-水飞蓟宾,采用纳米晶技术可改善其药动学特征。为考察纳米晶体内分布特征和粒径对其分布的影响,进行小鼠以20 nig·kg-1剂量分别尾静脉注射水飞蓟宾溶液、SN-A和SN-B后的组织分布研究。靶向指数、选择性指数、靶向效率和相对靶向效率评价指标均证实水飞蓟宾纳米晶具有肝脏被动靶向性；从药物浓度角度考察,纳米晶可降低血浆和心脏中水飞蓟宾浓度,增加肝脏中的浓度；从靶器官药量角度考察,溶液组在肝脏的分布比例介于15%-35%之间,SN-A和SN-B分布比例分别介于46%-63%和31%-67%之间,且在给药后10h内SN-A在肝脏的分布比例稳定在40%-50%之间,提示纳米晶SN-A小鼠尾静脉注射肝脏靶向性优于纳米晶SN-B。为考察纳米晶对水飞蓟宾口服吸收的影响,进行水飞蓟宾纳米晶SN-A和SN-B在Caco-2细胞中的跨膜转运研究,结果表明,当纳米晶中水飞蓟宾浓度低于125μg·ml-1时无细胞毒性,且药物不影响Caco-2细胞活性与增殖。在pH6.0和pH7.4的Hanks’缓冲液中,以水飞蓟宾原料药和物理混合物为参比对象,在pH6.0环境下,SN-A、SN-B和原料药的Papp分别为5.17±0.77×10-7 cm·s-1、6.43±0.41×10-7cm.s-1和2.47±0.4×10-7cm.s-1；在pH7.4环境下,SN-A、SN-B和原料药的Papp分别为5.73±0.75×10-7 cm·s-1、1.02±0.17×10-6 cm·s-1和2.70±0.44×10-7 cm·s-1。SN-A和SN-B均能提高水飞蓟宾表观渗透系数,提高药物跨膜转运速率,且SN-B的表观渗透系数大于SN-A。为进行纳米晶体外药效学考察,以浓度为5 mM的H2O2与HL7702细胞孵育24 h,建立体外肝细胞化学性损伤模型；HL7702肝细胞损伤模型预防性给药时,水飞蓟宾溶液组保护作用呈浓度依赖性,且在10μg·ml-1时保护作用最强,SN-A在50μg·ml-1时最强,并且SN-A的保护效应强于溶液组；HL7702肝细胞损伤模型治疗性给药时,溶液组和SN-A的保护作用未及预防性给药时明显。HL7702肝细胞HE染色证实,以10μg·ml-1预防性给药时,SN-A组细胞数目较多,分布规则,胞浆丰满,细胞核形态及核质比接近于正常细胞；溶液组细胞状况介于模型组和SN-A组之间,个别细胞出现碎核。因此,水飞蓟宾可预防性保护肝细胞免受H2O2的损伤,且SN-A的保护效果优于溶液组。为进行纳米晶体内药效学考察,以CCl4的花生油溶液（1：1,w/w）按照1ml·kg-1剂量皮下多点注射建立Beagle犬急性肝损伤模型,SN-A滴注给药15mg·kg-1、SN-B灌胃给药20mg·kg-1,复方甘草酸单铵为阳性对照,并设模型组和水飞蓟宾溶液对照组,检测AST、ALT、TBIL等肝功指标,测定肝脏SOD和MDA活性,病理切片检查肝组织病理改变,考察水飞蓟宾纳米晶口服和静脉给药的安全性和有效性。经肝功能检测和肝病理切片观察证实,本文成功建立了CCl4致Beagle犬急性肝损伤模型。与水飞蓟宾溶液组相比,纳米晶可更有效的将偏离正常值的AS、ALT、ALP、TBIL、GGT等向正常值调整回归,并增加肝组织中SOD活性,降低MDA产生量,减少肝细胞气球样变和炎性细胞浸润,避免大面积坏死,保护肝细胞核膜完整性,稳定肝细胞。因此,水飞蓟宾纳米晶SN-B口服给药和SN-A静脉注射给药可有效预防CCl4引起的Beagle犬急性肝损伤,且不会产生药源性肝损伤,进一步证实纳米晶可显著提高水飞蓟宾口服生物利用度和静脉给药靶向性,提高水飞蓟宾的保肝药效作用。本文成功构建了供注射和口服给药的水飞蓟宾纳米晶释药系统,并进行了体内外评价。应用活塞-缝隙式高压均质法制备了供口服和静脉给药的水飞蓟宾纳米晶,并以甘露醇为保护剂进行冷冻干燥提高其稳定性,水飞蓟宾晶型保持不变,粒度分布均匀,溶解度和溶出速率增加,具备良好的制剂学特性。纳米晶可提高水飞蓟宾的口服生物利用度,增加Caco-2细胞跨膜转运系数；延长静脉滴注给药时水飞蓟宾半衰期,并增加肝脏靶向效率。纳米晶可增强水飞蓟宾口服和静脉给药时对Beagle犬急性肝损伤的保护作用。因此,本文研究表明,纳米晶可提高水飞蓟宾口服生物利用度和并实现静脉被动肝脏靶向传输给药,纳米晶技术是改善包括水飞蓟宾在内诸多难溶性药物体内外功效的重要途径。

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中文摘要

ABSTRACT

符号说明

前言

1 纳米晶概述

2 纳米晶给药途径与优点

3 纳米晶制备方法

4 模型药物选择依据

5 本课题设计思想、研究内容及意义

第一章处方前研究

1 仪器与试药

2 方法与结果

2.1 水飞蓟宾体外分析方法的建立

2.2 水飞蓟宾基本理化性质研究

3 小结

第二章水飞蓟宾纳米晶的工艺研究与处方筛选

第一节水飞蓟宾纳米晶的工艺研究

1 仪器与试药

2 方法与结果

2.1 高压均质过程对水飞蓟宾稳定性的影响

2.2 高压均质技术重现性研究

2.3 均质压力对粒径的影响

2.4 均质次数对粒径的影响

3 讨论

第二节水飞蓟宾纳米晶处方筛选

1 仪器与试药

2 方法与结果

3 讨论

第三节水飞蓟宾纳米晶冷冻干燥研究

1 仪器与试剂

2 实验方法与结果

2.1 冻干保护剂的筛选

2.2 冻干工艺研究

3 讨论

第三章水飞蓟宾纳米晶制剂学性质研究

1 实验材料

1.1 仪器

1.2 试剂

2 方法与结果

2.1 水飞蓟宾纳米晶的制备

2.2 激光粒度分布与Zete-电位测定

2.3 透射电子显微镜分析

2.4 原子力显微镜分析

2.5 扫描电子显微镜分析

2.6 差示扫描量热分析

2.7 粉末X-射线衍射分析

2.8 体外释药特性研究

2.9 饱和溶解度分析

2.10 比表面及孔隙度测定

2.11 稳定性加速实验

3 讨论

第四章 Beagle犬体内药动学及小鼠体内分布研究

第一节生物样品中水飞蓟宾检测方法的建立

1 材料与动物

1.1 仪器

1.2 试剂

1.3 实验动物

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.2 样品处理

2.3 方法专属性

2.4 标准曲线的制备

2.5 回收率考查

2.6 精密度考查

2.7 稳定性考查

2.8 质控样品的监测

3 讨论

第二节水飞蓟宾纳米晶在Beagle犬体内药动学研究

1 材料与动物

1.1 仪器

1.2 试剂

1.3 实验动物

2 实验方法

2.1 纳米晶口服给药

2.2 纳米晶静脉滴注给药

2.3 数据处理

3 实验结果

3.1 口服给药结果

3.2 注射给药结果

4 讨论

第三节水飞蓟宾纳米晶在小鼠体内分布研究

1 材料与动物

1.1 仪器与试剂

1.2 实验动物

2 实验方法

2.1 动物分组与给药

2.2 样品的采集和检测

3 实验结果

3.1 纳米晶在各器官内的实测浓度

3.2 纳米晶在各器官内的分布比例

3.3 纳米晶各时间点分布特征

3.4 纳米晶靶向性评价

4 讨论

第五章纳米晶促水飞蓟宾跨膜转运研究

1 材料与细胞

1.1 仪器

1.2 试剂

1.3 细胞

2 实验方法

2.1 Caco-2细胞培养

2.2 纳米晶对Caco-2增殖影响

2.3 纳米晶对Caco-2跨膜转运影响

2.4 数据分析

3 实验结果

4 讨论

第六章水飞蓟宾纳米晶体内外药效学研究

第一节 HL7702肝细胞损伤模型的建立

1 实验材料

1.1 仪器

1.2 试剂

1.3 细胞

2 实验方法

2.1 细胞培养

2.2 肝细胞损伤模型的建立

2.3 数据处理

3 实验结果

4 讨论

第二节纳米晶SN-A对HL7702肝细胞损伤药效学研究

1 实验材料

1.1 仪器

1.2 试剂

1.3 细胞

2 实验方法

2.1 溶液配制

2.2 实验步骤

3 实验结果

2O₂肝细胞损伤的影响'>3.1 SN-A预防性给药对H₂O₂肝细胞损伤的影响

2O₂肝细胞损伤的影响'>3.2 SN-A治疗性给药对H₂O₂肝细胞损伤的影响

4 讨论

第三节 HE染色观察SN-A对HL7702形态的影响

1 实验材料

1.1 仪器

1.2 试剂

1.3 细胞

2 实验方法

2.1 细胞培养

2.2 试剂配制

2.3 细胞处理

2.4 HE染色

3 实验结果

4 讨论

第四节水飞蓟宾纳米晶对Beagle犬化学性急性肝损伤的影响

1 材料与动物

1.1 仪器

1.2 试剂

1.3 动物

2 实验方法

2.1 分组

2.2 造模与取血

2.3 生化分析

2.4 病理分析

3 实验结果

3.1 动物饲养观察

3.2 血液生化检测结果

3.3 肝组织病理改变

4 讨论

全文小结

参考文献

致谢

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水飞蓟宾纳米晶释药系统的构建与评价

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