伪狂犬病毒基因组在潜伏感染中的时空表达

论文摘要

伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一种具有神经嗜性的α型疱疹病毒，可感染猪、牛、羊等多种家畜及野生动物。疫苗免疫只能阻止动物发病和临床症状的产生，但不能阻止病毒在宿主体内建立潜伏感染。如果淘汰全部PRV潜伏感染猪，需要付出巨大的经济和社会代价，不符合我国当前的国情。所以伪狂犬病毒的潜伏感染已成为预防和根除伪狂犬病的重大障碍。本试验以PRV在猪体内建立潜伏感染为基础，从DNA、RNA等不同层次水平上检测了IE180、EP0、LAT等PRV潜伏感染相关基因在潜伏感染的建立、维持和激活过程中的时空表达情况，确定影响PRV潜伏感染的关键基因，为剖析PRV潜伏感染的机理和伪狂犬病的根除计划提供实验数据和理论依据。本试验购买30日龄PRV阴性健康仔猪，进行首免和加强免疫，用ELISA和中和试验检测仔猪血清抗体水平，当血清抗体水平达到1：2或1：2以上时，我们分别通过滴鼻和颈部肌肉注射各2 mL病毒液(PRV gG-／LacZ+，TCID50=10-6.5／0.1mL)对仔猪进行攻毒。攻毒后1周内每天上午和下午分别采集攻毒猪的鼻拭子和测量体温，通过PCR方法检测PRV的糖蛋白gD基因，发现攻毒4天后猪不再向外界排毒；体温测量结果表明，攻毒后猪只体温迅速升高，在2天左右达到峰值，而后慢慢降低；每隔一周，我们剖杀试验感染猪，采集血清和三叉神经节、脑、嗅球等神经组织及心肌、肺、肝脏、脾脏等脏器，于-80℃冷冻保存。攻毒45天后，我们按2mg／kg体重的剂量通过颈部肌肉注射地塞米松，连续注射5天，以激活PRV的潜伏感染。病毒激活后我们依然每天采集鼻拭子和测量体温，其结果与攻毒后排毒情况和体温变化结果基本一致。在实验室条件下，我们提取冻存组织的DNA，通过gD-PCR方法检测病毒在猪体内的组织分布。验证了神经组织，尤其是三叉神经节是病毒建立潜伏感染的最主要位置。本实验中，检出率最高的器官为三叉神经节和脑干，均为100％，其次为嗅球、大脑，小脑等神经组织，此外淋巴结和脾脏等淋巴器官的检出率也较高，心、肝、肾等脏器的检出率较低。我们知道，PRV基因组的转录是级联式的，即立即早期基因、早期基因和晚期基因是按照时间的先后顺序依次表达，后一期基因的表达依赖于上一期基因的表达。我们选取IE180、EP0和LAT等PRV潜伏感染相关基因作为研究对象，在RNA水平上检测了各基因的时空表达表达情况。检测结果发现，在潜伏感染过程中，除了LAT的大量存在和表达外，IE180基因的表达也是持续存在的；而EP0基因一旦在激活中晚期基因的表达后就立即停止自身的表达；晚期糖蛋白基因gD的表达依赖于IE180基因和EP0基因的共同作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 疱疹病毒及潜伏感染
• 1.1.1 疱疹病毒分类及特性
• 1.1.2 疱疹病毒的潜伏感染
• 1.1.2.1 疱疹病毒潜伏感染的三个阶段
• 1.1.2.2 潜伏感染的部位
• 1.1.2.3 潜伏感染的动物模型
• 1.1.3 潜伏感染的分子机理
• 1.1.3.1 潜伏相关转录体（latency-associated transcript,LAT）
• 1.1.3.2 潜伏感染时的基因表达
• 1.1.3.3 病毒蛋白16及组蛋白修饰
• 1.2 伪狂犬病毒的潜伏感染
• 1.2.1 伪狂犬病毒
• 1.2.1.1 伪狂犬病毒及其危害
• 1.2.1.2 伪狂犬病毒的检测和诊断
• 1.2.1.3 伪狂犬病毒的应用
• 1.2.2 伪狂犬病毒的潜伏感染
• 1.2.2.1 伪狂犬病毒潜伏感染的分子机理
• 1.2.2.2 潜伏感染的检测方法
• 2 研究目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 细胞、病毒和质粒
• 3.1.2 工具酶和主要试剂
• 3.1.3 培养基和缓冲液
• 3.1.4 试验动物
• 3.2 方法
• 3.2.1 猪伪狂犬病毒潜伏感染模型的建立
• 3.2.1.1 疫苗免疫
• 3.2.1.2 攻毒
• 3.2.1.3 注射地塞米松激活病毒
• 3.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化和提取
• 3.2.3 间接ELISA方法
• 3.2.4 细胞培养及病毒增殖
• 50的测定及血清中和试验'>3.2.5 PRV TCID₅₀的测定及血清中和试验
• 3.2.6 鼻拭子模板的制备
• 3.2.7 组织中病毒核酸的提取
• 3.2.8 PCR及RT-PCR方法的建立
• 4 结果与分析
• 4.1 猪血清样品检测结果
• 4.1.1 免疫前血清样品检测
• 4.1.2 免疫后每周血清样品抗体检测
• 4.1.3 攻毒后血清样品ELISA检测
• 50的测定'>4.2 病毒TCID₅₀的测定
• 4.3 血清中和试验（SN）结果
• 4.4 猪体温变化结果
• 4.4.1 攻毒后猪只体温变化曲线图
• 4.4.2 潜伏感染再激活后猪只体温变化曲线图
• 4.5 攻毒后一周内鼻拭子排毒情况检测
• 4.6 组织病料中病毒DNA的检测
• 4.7 组织与病毒总RNA的提取与检测
• 4.8 潜伏感染过程中PRV DNA和mRNA的组织分布
• 5 讨论
• 5.1 PRV潜伏感染在猪体内的建立、维持及激活
• 5.1.1 免疫程序
• 5.1.2 攻毒后和潜伏感染再激活猪的体温变化
• 5.2 病毒DNA在猪体内的组织分布
• 5.2.1 病毒DNA的提取
• 5.2.2 PRV基因组的PCR扩增
• 5.2.3 潜伏感染的部位
• 5.3 病毒mRNA在猪体内的组织分布
• 5.3.1 关于EP0、IE180、LAT等潜伏感染相关基因的选择
• 5.3.2 病毒mRNA的提取
• 5.3.3 RT-PCR扩增
• 5.3.4 潜伏感染中PRV基因组时空表达的规律与下步工作展望
• 结论
• 参考文献
• 致谢