论文摘要
目的:二烯丙基二硫（diallyl disulfide, DADS）可以诱导多种肿瘤细胞周期阻滞而引起增殖抑制,但其分子机制尚不十分清楚。本实验构建pcDNA3.1（+）/Chk1、pcDNA3.1（+）/Chk2真核表达载体,建立Chk1、Chk2基因高表达的BGC823细胞系,探讨Chk1和Chk2基因对DADS G2/M期阻滞作用及检查点激酶通路的影响。方法:构建重组真核表达载体pcDNA3.1（+）/Chk1、pcDNA3.1（+）/Chk2,将重组质粒转染入BGC823细胞,并用G418筛选,运用RT-PCR,Western Blot进行验证。选择高表达细胞株,通过HE染色、绘制生长曲线及流式细胞仪分析等方法,观察Chk1和Chk2基因高表达后BGC823细胞形态、生长速度和细胞周期分布变化。Western Blot检测DADS对转染细胞检测点激酶表达影响。流式细胞术检测对细胞周期的影响。结果:流式细胞术结果显示:15mg/L DADS可阻滞BGC823细胞于G2/M期。15mg/LDADS作用12 h,G2/M期百分率增加到19.5%,与对照组9.1%相比有明显差异（P<0.05）;24 h时,G2/M期百分率进一步增加到39.9%,比对照组15.5%升高了2倍多;作用36h,G2/M期百分率达32.5%,与对照组14.8%相比有明显差异（P<0.05）;48h后,G2/M期百分率为19.9%,仍高于对照组（P<0.05）。菌落PCR和测序法证实成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1（+）/Chk1、pcDNA3.1（+）/Chk2。将重组质粒转染入BGC823细胞,并用G418筛选获得稳定表达Chk1、Chk2的细胞株,显微镜下观察转基因组细胞核浆比例减少;绘制生长曲线表明转Chk1组较BGC823组和空载体组生长速度减慢,P <0.05;转Chk2组较BGC823组和空载体组生长速度稍减慢,P >0.05;流式细胞术结果显示高表达Chk1的转基因组较两对照组G2/M期细胞比例明显增加,P<0.05,肿瘤细胞被阻滞于G2/M期;高表达Chk2的转基因组较两对照组G2/M期细胞比例无明显改变,P>0.05。Western Blotting结果显示15mg/L DADS处理2、4、8、12h后,与对照组比较,p-Chk1表达呈时间依赖性增强, Chk1总蛋白表达无改变;p-Chk2、Chk2总蛋白表达无改变;15mg/L DADS处理BGC823细胞12h后,Cdc25C磷酸酶的表达与对照组相比明显下降,并一直持续至48h。流式细胞术结果显示:在Chk1基因转染BGC823细胞后加入DADS 24h、48h,与单独转染Chk1基因相比其G2/M期百分率明显增加,差异有显著性P <0.05。结论:1.成功构建高表达Chk1、Chk2人胃癌BGC823细胞系。2. Chk1转染可明显抑制BGC823细胞增殖,肿瘤细胞被阻滞于G2/M期。3. DADS阻滞G2/M期可能是使Chk1磷酸化后,通过Chk1/Cdc25C信号通路发挥作用。4. Chk2可能不参与DADS对胃癌G2/M期的阻滞作用。