偏肿革裥菌3个锰过氧化物酶基因的克隆与表达分析

论文摘要

木材白腐菌能够降解植物细胞壁中最难分解的木质素,由白腐菌分泌的木质素降解酶类主要包括漆酶（Laccase）、木质素过氧化物酶（Lignin Peroxidase）、锰过氧化物酶（Manganese Peroxidase, MnP）以及多功能过氧化物酶（versatile peroxidase, VP）。偏肿革裥菌是对木材和木质素分解能力较强的一种白腐菌,广泛分布于我国东北林区。其产漆酶和MnP的活性较高,并对其培养特性、漆酶、LiP及MnP基因克隆及在毕赤酵母与构巢曲霉中表达方面已有一系列研究。因此,继续研究偏肿革裥菌分解木质素的多个同工酶系及表达调控,有助于弄清偏肿革裥菌分解木质素的作用机理。本文对偏肿革裥菌菌株CB-13个MnP同工酶基因进行了初步研究,研究结果主要为：1.运用RT-PCR与RACE等方法获得的3个MnP基因片段,以染色体步移法获得偏肿革裥菌3个MnP基因的DNA全长序列,分别命名为Lgmnp1、Lgmnp2、Lgmnp3（GenBank的登录号分别为：JQ327834, JN571114, JN571116）。3条基因都具有5个内含子,开放阅读框（ORFs）分别为1095bp,1098bp,1101bp,各自编码364,365,及366个氨基酸。Lgmnp1cDNA全长与Trametes versicolor mnp （AJ745879）同源性评价最高,相似性都达83%, Lgmnp2cDNA全长与T. versicolor mnp （AJ745879, AY677131）相似性为80%, Lgmnp3cDNA全长与T. versicolor mnp （AY677129）相似性最高,达83%。2.利用荧光定量PCR研究了偏肿革裥菌3个MnP基因在不同锰离子浓度下的表达情况,结果表明：这3个基因在任何时间均有表达但表达量各不相同。Lgmnp1的相对表达量要明显高于Lgmnp2与Lgmnp3。Lgmnp1的相对表达量与Lgmnp2差异最大时为18.5倍,Lgmnp1与Lgmnp3的相对表达量差异最大时可达48倍。Lgmnp1明显受Mn2+的调控,在8d高Mn2+时表达量最高,而Lgmnp2、Lgmnp3并没有明显受到Mn2+浓度的影响,说明这两个同工酶不受到Mn2+的调节。在各种培养条件下,Lgmnp2的相对表达量要比Lgmnp3的要高3至5倍。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 木材白腐菌概况及其对木质素的降解
• 1.2 白腐菌木质素降解酶类
• 1.3 锰过氧化物酶
• 1.4 锰过氧化物酶基因的研究进展
• 1.4.1 MnP同工酶基因克隆
• 1.4.2 MnP同工酶基因的基因组、转录组水平研究概况
• 1.5 染色体步移技术原理
• 1.6 研究内容
• 1.7 课题来源
• 2 偏肿革裥菌MnP同工酶基因的克隆与分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验菌种
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 试验引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 菌种活化及扩大培养
• 2.2.3 提取偏肿革裥菌菌丝体基因组DNA
• 2.2.4 偏肿革裥菌总RNA的提取
• 2.2.5 5’RACE
• 2.2.6 PCR产物的胶回收、T载体克隆及测序
• 2.2.7 3’RACE
• 2.2.8 偏肿革裥菌MnP同工酶DNA片段的获取
• 2.2.9 染色体步移
• 2.2.10 偏肿革裥菌MnP 3个同工酶基因的序列分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 偏肿革裥菌基因组DNA的提取
• 2.3.2 偏肿革裥菌总RNA的提取
• 2.3.3 5’RACE
• 2.3.4 3’RACE
• 2.3.5 偏肿革裥菌MnP同工酶DNA片段的获取
• 2.3.6 染色体步移获得偏肿革裥菌MnP同工酶基因全长
• 2.3.7 偏肿革裥菌MnP 3个同工酶基因的序列分析
• 2.4 本章小结
• 3 偏肿革裥菌MnP同工酶基因相对表达量分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 供试菌种
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要培养基
• 3.1.4 试验引物
• 3.1.5 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 偏肿革裥菌gpd内参基因扩增
• 2+诱导处理'>3.2.2 偏肿革裥菌菌丝的Mn²⁺诱导处理
• 3.2.3 偏肿革裥菌总RNA的制备及质量检测
• 3.2.4 偏肿革裥菌3个mnp及内参gpd cDNA片段RT-PCR扩增
• 3.2.5 Real-time PCR
• 3.2.6 偏肿革裥菌漆酶基因荧光定量数据分析方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 偏肿革裥菌内参基因gpd DNA片段的扩增
• 3.3.2 偏肿革裥菌MnP基因荧光定量引物验证
• 3.3.3 Lgmnp1,Lgmnp2,Lgmnp3基因表达分析
• 3.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 偏肿革裥菌3’RACE两条片段的比较
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢