与肝细胞肝癌相关的两个基因KIAA0101，DLK1的功能研究

论文摘要

根据世界卫生组织（WHO）2004年公布的资料显示在过去10年间全球癌症的发病率及死亡率增长了22％，其中肝癌无论从发病率还是死亡率来看，均为全球对人类身体健康危害最大的癌症之一。尤其在东亚和非洲。在我国，肝癌是发病率仅次于胃癌的高发癌症。肝癌和其它肿瘤一样是遗传和环境等诸多因素的相互作用所致，涉及大量相关基因的结构和表达调控的改变。因此克隆，筛选和鉴定与肝癌相关的基因仍然是肝癌分子生物学研究领域的一个前沿和重点研究课题。 寻找肝癌相关基因的首要步骤之一是得到在肝癌组织中异常表达的基因。我们实验室运用cDNA芯片的方法获得了一批在肝癌中异常表达的已知和未知基因。对这些基因的进一步功能研究将有助于对肝癌发病分子机理的深入了解。我们首先挑选了15个在芯片结果显示有差异表达的基因，并扩大组织样本，运用半定量RT-PCR方法做进一步验证。得到了2个较有意义的基因：KIAA0101和DLK1。本课题对这两个基因与肝癌的相关性进行较深入的研究。 KIAA0101，cDNA全长888bp，编码111个氨基酸，已经有报导在甲状腺癌，结肠癌和非小细胞肺癌中在mRNA水平上有异常表达，但在肝癌中尚无表达状态的报导。先前的cDNA芯片结果提示KIAA0101在肝癌组织中表达较高，进一步运用半定量RT-PCR方法显示在8／15对样本中，癌组织表达高于相应的癌旁肝组织。利用原核表达系统表达了KIAA0101的蛋白并制备多克隆兔抗体，Western blot结果显示在25／30对组织标本中肝癌组织中蛋白表达比相应的癌旁肝组织低，与mRNA的表达情况相反。组织芯片免疫组化结果显示，在107／161例肝癌组织中，KIAA0101表达为弱阳性（+）或阴性（-）；而在相应的癌旁肝组织中，仅有24／161例为弱阳性（+）或阴性（-），统计学上有显著差异（P＜0.05）。我们的结果显示KIAA0101 mRNA和蛋白表达水平在肝癌组织中的表达呈负相关性。生物信息学提示KIAA0101蛋白定位于细胞内的线粒体，双重免疫荧光的方法显示KIAA0101可与线粒体内膜蛋白的荧光图像大部分重叠，表明蛋白大部分定位于线粒体内，同时少数位于核内。利用线粒体特异性抗体从细胞总蛋白内富集细胞内线粒体蛋白，运用Western blot方法也得到了相似的结果。将KIAA0101组建表达载体并转染肝癌细胞后，应用pMACS KKⅡ磁珠分选系统将KIAA0101瞬时高表达的细胞分离。体外生长曲线表明KIAA0101对细胞的生长有抑制作用（P＜0.05）；流式细胞仪分析结果显示KIAA0101高表达阳性细胞的S期比例为21.35％±1.28，而相应的对照细胞S期比例为29.45％±1.45，具有统计学意义（P＜0.05）。由此可见，KIAA0101瞬时高表达可以阻滞细胞G1期向S期的过渡从而对细胞的生长有抑制作用。我们的研究结果表明KIAA0101与肝癌的发生发展有一定的相关性。因此KIAA0101将可列为肝癌分子分型的生物标志物的一个候选者，用于对肝癌生长速度，预后及其它生物学行为的一种参考指标。 DLK1（delta like protein）是一个跨膜蛋白，由383氨基酸组成，胞外有6个EGF结构域，1个跨膜结构域和1个胞内区。它与notch-1的配体delta有较高的同源性，但因它不具有与notch-1相结合所必需的DZL结构域，故推测它们互相之间不能结合。DLK1与脂肪细胞的形成密切相关，高表达时能够抑制脂肪细胞的生成。DLK1是一个父系表达的印迹基因。已经证明DLK1可以增加某些未分化神经肿瘤的恶性程度，在神经母细胞瘤、小细胞肺癌、神经内分泌肿瘤、脑瘤和血液病中高表达。另外它在血液和肝脏的祖细胞中高表达，已经成为祖细胞的标志之一。在小鼠的实验中，RT-PCR方法证明DLK1在胚胎肝组织中高表达而在成体肝组织不表达。在鼠胚胎肝中利用DLK1的抗体可以分离出成肝细胞；体外培养实验中，分离得到的DLK1+肝细胞增值活性高于DLK1-肝细胞。因此我们选择DLK1作进一步研究。半定量RT-PCR（5／14），Northern blot（4／12）和Western blot（6／17）结果中显示DLK1在部分肝癌组织中的mRNA和蛋白表达均高于相应的癌旁肝组织。4例肝癌细胞株中，一株高表达（Hep3B）而另外三株（SMMC 7721，7402和HepG2）没有检测到表达。在SMMC 7721细胞株转染筛选获得了高表达DLK1的稳定细胞株，同时运用腺病毒包装系统构建出含有DLK1的病毒。体外试验中，稳定表达DLK1的SMMC7721克隆株和利用腺病毒瞬时感染高表达的DLK1的SMMC7721细胞均比对照细胞生长较快（P＜0.05）。裸鼠体内成瘤试验也表明稳定高表达DLK1对SMMC7721肝癌细胞的生长起促进作用。利用nocodazol阻滞细胞于G2／M期后，在不同的间隔时间作细胞周期分析。结果显示DLK1能够使细胞较快地从G2／M期过渡到S期（实验组为16小时，而对照组为21小时）。在信号转导通路中，发现DLK1高表达的细胞中，细胞周期相关基因p34cdc2的蛋白表达虽然没有变化，但15位酪氨酸的磷酸化状态降低。已经有报导p34cdc2蛋白的15位酪氨酸的低磷酸化可以导致蛋白活性的增加从而加快细胞周期循环。我们进行的p34cdc2蛋白体外激酶活性试验中显示，在DLK1高表达的细胞株中p34cdc2的激酶活性升高。在肝癌组织标本中，双重免疫荧光显示DLK1高表达的肝癌细胞中，AFP表达也较强，二者有明显的相关性。提示DLK1高表达的肝癌细胞处于低分化状态，而其增值能力比较强。综上所述，DLK1在部分肝癌组织中处于高表达的状态；在低表达的肝癌细胞株SMMC7721转染DLK1后，体内外实验结果表明可以促使肿瘤细胞生长。DLK1可能对部分肝癌的发生发展起一定的作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 KIAA0101在肝癌中的异常表达及对肝癌细胞株的生长抑制作用
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 DLK1在肝癌组织中表达状态的鉴定及对肝癌细胞生长的影响
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 致谢