云南红豆杉内生真菌的固定化及其GGPP酶的研究

论文摘要

筛选和应用红豆杉内生真菌发酵生产紫杉醇已成为当前医药领域研究的热点之一。GGPP合成酶是紫杉醇生物合成途径中的关键酶,能够催化合成紫杉烷类化合物的共同前体——牻牛儿牻牛儿焦磷酸酯（简称GGPP）。利用固定化技术发酵生产代谢产物,由于固定化酶具有可长期重复使用,连续发酵和简化代谢产物分离过程等优点,是一种很有发展前景的新型技术。因此,本文以产紫杉烷类化合物的云南红豆杉内生真菌菌株12.3.2作为研究对象,对其生理特性、固定化条件和GGPP合成酶活性进行了一系列初步研究。首先,考察了培养基与培养条件对其生理特性的影响,研究发现:温度对菌丝体生长具有明显的影响,最适温度为30℃;pH值在前24小时呈下降趋势,然后开始逐步升高,在5天后趋于稳定,综合pH的变化,菌株在中性条件时生长良好,在接种后3天菌丝体干质量可达到最大值;蔗糖对菌丝体的生长最为有利,对有机氮的利用要优于对无机氮的利用;菌丝体干质量与培养基质量浓度呈正向关系,而且较高的培养基质量浓度对其生长没有抑制作用;对维生素依赖性不强,但添加适量的维生素可以促进其生长。其次,建立TTC法测定红豆杉内生真菌分生孢子的脱氢酶酶活,并以此来考察固定化效果。用海藻酸钙包埋云南红豆杉内生真菌12.3.2分生孢子制成固定化孢子的微胶珠。通过TTC法测定红豆杉内生真菌分生孢子的脱氢酶活力,并以此来考察固定化粒径、海藻酸钠的浓度、CaCl2浓度、单位凝胶分生孢子量、固定化时间以及温度等六个因素对固定化效果的影响。通过实验确定,当海藻酸钠浓度为4.0%,CaCl2浓度为2.6%,固定化时间为6 h,温度为40℃,单位凝胶中分生孢子量应为1 mL/10g凝胶（孢子悬液浓度为2.3×109个/mL）,此条件下包埋率为46%,此时内生真菌12.3.2活力最强,固定化效果最佳。因此,TTC法可以准确反应红豆杉内生真菌分生孢子的固定化效果,固定的分生孢子具有更好的发酵特性。最后,初步探讨了GGPP合成酶活性的检测。该酶属于异戊烯基转移酶,催化FPP与IPP发生亲电子耦合形成GGPP。对产紫杉烷类化合物的菌株12.3.2的GGPP合成酶活性进行检测,与标准品对比进行定性分析,确定其内含有GGPP合成酶。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 红豆杉内生真菌的研究
• 1.1.1 国外红豆杉内生真菌的研究现状
• 1.1.2 国内红豆杉内生真菌的研究现状
• 1.1.3 云南红豆杉内生真菌的研究现状
• 1.2 固定化技术
• 1.2.1 固定化技术概述
• 1.2.2 细胞固定化方法分类
• 1.2.3 固定化细胞的优缺点
• 1.2.4 微胶囊技术
• 1.2.5 海藻酸钠微胶囊
• 1.2.6 海藻酸钙微胶珠
• 1.2.7 固定化细胞生长繁殖
• 1.2.8 包埋工艺对细胞生产与生长的影响
• 1.2.9 海藻酸钙微胶珠包埋材料的特定作用
• 1.3 萜类的生物合成
• 1.3.1 萜类及其功能
• 1.3.2 萜类化合物的代谢途径
• 1.3.3 GGPP合成酶（GGPPs）
• 1.4 本文的研究目的及主要研究内容
• 1.4.1 研究目的
• 1.4.2 研究内容
• 第二章 云南红豆杉内生真菌12.3.2的生理特性
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 生物与化学试剂
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 接种方法
• 2.2.2 菌种活化
• 2.2.3 菌丝体生长条件实验方法
• 2.2.4 菌丝体生长量测定
• 2.2.5 生物学特征描述
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 生长特性
• 2.3.2 温度对菌丝体生长的影响
• 2.3.3 pH值对菌丝体生长的影响
• 2.3.4 碳源对菌丝体生长的影响
• 2.3.5 氮源对菌丝体生长的影响
• 2.3.6 培养基质量浓度的变化对菌丝体生长的影响
• 2.3.7 维生素对菌丝体生长的影响
• 2.4 本章小结
• 第三章 云南红豆杉内生真菌分生孢子的固定化研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 生物与化学试剂
• 3.1.4 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 TTC法原理
• 3.2.2 标准曲线的制作方法
• 3.2.3 脱氢酶酶活力的定义
• 3.2.4 活菌计数法
• 3.2.5 固定化红豆杉内生真菌分生孢子的制备
• 3.2.6 利用TTC法测定固定化红豆杉内生真菌分生孢子的活力
• 3.2.7 固定化分生孢子包埋率的测定
• 3.2.8 微胶珠强度的测定
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 固定化粒径对固定化效果的影响
• 3.3.2 固定化时间对固定化效果的影响
• 3.3.3 海藻酸钠浓度对固定化效果的影响
• 3.3.4 氯化钙浓度对固定化效果的影响
• 3.3.5 单位凝胶中分生孢子量对固定化效果的影响
• 3.3.6 温度对固定化效果的影响
• 3.3.7 微胶珠强度的研究结果
• 3.4 结论与讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 菌株12.3.2中GGPP合成酶活性检测
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 生物与化学试剂
• 4.1.4 实验仪器
• 4.2 实验步骤与方法
• 4.2.1 菌种活化
• 4.2.2 菌株12.3.2固体培养
• 4.2.3 GGPP合成酶活性检测方法
• 4.3 实验结果
• 4.4 实验结论与讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录