青岛野生种群不同倍性龙须菜AFLP遗传多样性分析以及与性别相关SCAR标记的开发与验证

论文摘要

龙须菜是重要的产琼胶大型红藻,人工选育的981和07-2已经在我国南北方海域进行了广泛的栽培。藻类学家发现,龙须菜能够净化海水,吸收P、N等富营养元素,解决近岸海水的富营养化现象,对海洋环境起到生态修复作用。龙须菜也是理论研究的好材料,龙须菜的生活史、细胞结构、染色体数目等都已经有了系统的研究。龙须菜的分子生物学研究近年来也得到广泛的开展。由于龙须菜的生活史为同型世代交替的生活史,在同一时间同一空间存在不同世代的藻体,而对于不同世代藻体的遗传多样分析还没有报道。本文运用AFLP分子标记技术分析不同世代不同倍性的藻体,以揭示龙须菜不同世代及倍性的遗传差异,这些差异可以为龙须菜的育种工作提供指导和思路。以青岛湛山湾的7株单倍体龙须菜和7株二倍体龙须菜以及青岛台湾路的9株单倍体龙须菜和4株二倍体龙须菜为实验材料,采用AFLP技术,分析了同一地理群体内不同倍性种群的遗传多样性以及不同地理群体相同倍性种群的遗传多样性,并做了单倍体和二倍体种群间的遗传多样性分析。湛山湾单倍体种群内的各项遗传多样性数值分别为:Na 1.1699、Ne 1.0950、H 0.0582、I 0.0884、P 16.99%,二倍体种群内的各项遗传多样性数值为:Na 1.3333、Ne 1.2270、H 0.1297、I 0.1908、P 33.33%,台湾路单倍体种群内的各项遗传多样性数值为:Na 1.1373、Ne 1.0899、H 0.0504、I 0.0746、P 13.73%,二倍体种群内的各项遗传多样性数值为:Na 1.2092、Ne 1.1386、H 0.0825、I 0.1219、P 20.92%。所有单倍体种群的遗传多样性各项数值的Mean值为:Na 1.2092、Ne 1.0971、H 0.0576、I 0.0896、P 20.92%,所有二倍体种群的遗传多样性各项数值的Mean值为:Na 1.4248、Ne 1.3682、H 0.1946、I 0.2756、P 42.48%。通过比较,可以看出不同世代不同地理种群龙须菜的遗传多样性是有差别的,同一地理群体的二倍体在遗传变异上高于单倍体;不同地理群体的同一倍型种群,湛山湾种群的遗传变异总是大于台湾路种群的遗传变异。湛山湾-台湾路单倍体群体间各项遗传多样性数值为: H t0.0581、Gst 0.0669、Nm 6.9683,湛山湾-台湾路二倍体群体间各项遗传多样性数值为:Ht 0.1799、Gst 0.3271、Nm 1.0285,通过分析可知,单倍体群体的遗传多样性较低,Nm达到6.9683,单倍体种群间有很强的基因流动,湛山湾和台湾路的单倍体种群可以看作是一个随机群体,而二倍体之间已经有了多样性分化,Nm 1.0285说明二倍体之间有比较小的基因流动,说明单倍体和二倍体是处于不同分化层次的两个群体。通过分析可知,龙须菜不论单倍体还是二倍体的遗传多样性水平较低,这为育种策略的选择提供了依据,龙须菜的育种方向可从人工选择野生资源转向其它育种策略上。龙须菜的四分孢子体、雌配子体和雄配子体在性成熟前形态一致,性成熟后可通过生殖结构的不同进行性别或者世代的区分。本研究基于AFLP分子标记技术,研究性成熟后的龙须菜四分孢子体、雌配子体和雄配子体的AFLP指纹图谱,旨在得到能标记性别或者世代的差异条带,并将这些差异条带进行回收测序,作为能标记世代或者性别的SCAR标记,缩短与区分龙须菜性别或世代相关的实验的研究时间。以性成熟后的野生四分孢子体、雌配子体和雄配子体各8株为实验材料,利用AFLP分子标记技术,在7对引物中找到了一对能够标记四分孢子体和雌配子体的引物,该引物所扩增的特异条带不出现在雄配子体龙须菜中。将该条差异条带回收,测序后得到的DNA片段长402bp,在序列的两端设计了一对引物,进行验证实验。该引物能够在新的四分孢子体和雌配子体（各10株）基因组DNA中通过PCR技术稳定地扩增出目的条带,该目的条带不能在雄配子体（10株）中扩增出。与雌配子体以及四分孢子体相关的AFLP特异条带成功的转化成了SCAR标记,该SCAR标记鉴定基于PCR技术,快速稳定,为龙须菜的杂交育种工作缩短了4-6个月时间。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述和立项依据
• 1.1 龙须菜研究概述
• 1.1.1 龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）的生物学特性
• 1.1.2 龙须菜的经济价值和理论研究
• 1.2 分子标记概述及其应用
• 1.2.1 分子标记的概念
• 1.2.2 主要的分子标记的种类
• 1.2.3 AFLP 和SCAR 标记的应用
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第二章 青岛野生种群不同倍性龙须菜的 AFLP 遗传多样性分析
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.3 实验仪器和试剂
• 2.3.1 实验仪器
• 2.3.2 实验药品及试剂
• 2.3.3 部分主要试剂配方
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 龙须菜基因组DNA 的提取
• 2.4.2 酶切
• 2.4.3 连接
• 2.4.5 选择性扩增
• 2.4.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.4.7 数据统计与分析
• 2.5 实验结果
• 2.5.1 基因组DNA 的质量检测
• 2.5.2 基因组DNA 经限制性内切酶的酶切结果
• 2.5.3 预扩增结果
• 2.5.4 选择性扩增结果
• 2.5.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳的条带分离结果
• 2.5.6 数据统计与结果分析
• 2.6 讨论
• 2.6.1 基因组DNA 的提取及酶切
• 2.6.2 预扩增和选择性扩增
• 2.6.3 预扩增和选择性扩增的条件优化
• 2.6.4 龙须菜遗传多样性分析
• 第三章 龙须菜与性别相关的 AFLP-SCAR 标记的开发与验证
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料
• 3.3 实验仪器和方法
• 3.3.1 实验仪器
• 3.3.2 实验药品及试剂
• 3.3.3 部分主要试剂配方
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 龙须菜基因组DNA 的提取
• 3.4.2 基因组DNA 的酶切
• 3.4.3 连接
• 3.4.4 预扩增
• 3.4.5 选择性扩增
• 3.4.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.4.7 数据分析及统计
• 3.5 实验结果
• 3.5.1 特异片段的筛选
• 3.5.2 回收片段的序列及引物设计
• 3.5.3 SCAR 引物标记的验证
• 3.6 讨论
• 第四章 总结及对后续研究的影响
• 参考文献
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果
• 致谢