论文摘要
当前鱼类养殖所面临的种质退化、病害频发等问题日益突出,为了更好的解决这些生产上的难题,相关毒理药理、疫苗开发、遗传育种等研究必须进一步深入。采用体外培养鱼类细胞系进行相关研究具有成本小、可重复性高、研发实验周期短、能有效避免个体差异以及避免因个体极易死亡而导致的实验可操作性差等优点,而建立鱼类细胞系是实现上述诸多便利的基础环节。本研究采用鱼类组织体外培养法,结合不同鱼类物种、年龄差异采用不同方案,最终建立了来自欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）尾鳍组织,大黄鱼（Larimichthys crocea）脑组织、肝脏组织和肌肉组织的四个细胞系,分别命名为EEF、LYCB、LYCL和LYCMS。以DMEM/F12培养液为基础,添加β-巯基乙醇（2-ME）、肝细胞生长因子（HGF）、碱性成纤维生长因子（FGF-basic,人/鼠）、表皮生长因子（EGF）、羧甲基纤维素钠（CMC）、N-乙酰葡萄糖胺（N-AG）配制条件培养液,通过胰酶消化处理欧洲鳗鲡尾鳍组织块,倒置干贴24 h,加入条件培养液,成功进行了EEF原代培养。并通过经典胰酶消化法成功进行了EEF传代培养。说明此条件培养液适宜于淡水鱼类细胞原代、传代培养。使用上述条件培养液对海水鱼类原代培养进行尝试。将大黄鱼幼鱼组织块（肌肉、脑组织、肝脏）切碎不经胰酶消化直接倒置干贴,进行体外原代培养。最终成功实现这三个组织的原代培养,并将获得的原代细胞进行传代培养,建立了来自大黄鱼脑组织、肝脏及肌肉的三个可连续传代细胞系:LYCB、LYCL和LYCMS。这也说明本研究所配制条件培养液能满足来自淡水与海水鱼类的体外细胞系原代及传代培养的养分、pH、渗透压等需求。本研究通过检测不同传代比例对所建立细胞系的增殖曲线影响以及MTT法检测各生长因子对其增殖影响。结果显示不同的传代比例及生长因子对四种细胞系增殖均有影响,但对各个细胞系影响大小、显著程度各有不同。以上述四种细胞系为实验材料,进行了染色体数目分析。结果显示上述EEF细胞系54%的分裂相细胞染色体数目为38条;LYCB、LYCL、LYCMS细胞系分别有51%、56%、62%的分裂相细胞染色体数目为48条。相对较低的二倍体染色体数目比例说明上述四种鱼类细胞系在体外培养的过程中部分细胞染色体整倍性发生变化,这与现阶段关于体外培养的细胞系染色体数目与原物种呈现一定差异相一致。本研究对所建立的四个细胞系进行了冻存复苏、转染外源基因的尝试,结果显示这四种细胞系可以冻存复苏,可以用于外源基因的表达研究。