盐芥（Thellungiella halophila）ThPER42和ThPER32的克隆及分析

论文摘要

土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的一个非常重要的非生物胁迫因素,是现代生物科学迫切需要解决的问题。研究盐生植物的耐盐机理、利用遗传工程育种,提高植物的耐盐性成为当前的研究热点之一。近年来,盐芥作为一种新型耐盐模式植物用于植物耐盐分子生物学等方面的研究,有助于更好地了解植物对胁迫耐受性的相关机理。盐芥（Thellungiella halophila）是与拟南芥近缘的十字花科植物,具有很多与拟南芥相同的优点,但盐芥对多种胁迫的耐受能力远远高于拟南芥,它能够在高盐环境300mM NaCl下完成生命周期,是一种可耐受500mM NaCl的真正耐盐的植物。许多研究表明,植物的耐盐性常与其有效的抗氧化系统呈正相关,植物的抗氧化系统可分为酶促反应系统和非酶促反应系统。盐生植物和甜土植物在活性氧的清除机制上存在显著的差异,因此克隆盐芥中编码活性氧清除蛋白的过氧化物酶基因并研究其功能,对揭示植物的抗逆机理具有重要意义。本研究根据盐芥过氧化物酶已知EST片段,设计引物,利用RT-PCR和RACE的方法从盐芥的幼苗植株中成功克隆得到2个过氧化物酶基因ThPER42和ThPER32全长序列,并对其基因和氨基酸序列进行了初步研究。通过半定量RT-PCR方法,研究了不同盐浓度处理下盐芥叶和根中ThPER42和ThPER32表达量的差异。同时构建了ThPER42和ThPER32的原核表达载体,为进一步研究基因功能奠定了基础。研究结果表明,盐芥ThPER42 cDNA全长1429bp,编码331个氨基酸,分子量约为37kD,pI为7.64。它与拟南芥AtPER42有最高的同源性,同源性达96%。ThPER32 cDNA全长1309bp,编码353个氨基酸,分子量约为38KD,pI为6.58,它与拟南芥AtPER32同源性高达91%。推测盐芥ThPER42和ThPER32蛋白均没有跨膜区,为分泌蛋白,且氨基酸序列经SMART网站分析均属于过氧化物酶家族。通过半定量RT-PCR研究,ThPER32的表达模式与ThPER42不同,ThPER32在叶中为诱导表达,但在根中则表现为组成型表达,而ThPER42在叶和根中均为组成型表达。不同的表达模式提示,过氧化物酶家族基因成员众多,作用复杂,每一个成员都以各自的表达模式参与胁迫反应。本研究首次从盐生模式植物盐芥幼苗植株中克隆了两个过氧化物酶基因ThPER42和ThPER32,并对其性质和结构进行了初步研究,发现了在叶中盐诱导表达的基因ThPER32,对研究盐芥这种新型耐盐模式植物的耐盐机理以及其过氧化物酶家族积累了数据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第一章 研究目的及意义
• 1.1 盐芥耐盐机理研究的目的及意义
• 1.2 盐芥中过氧化物酶基因克隆的目的及意义
• 第二章 国内外研究进展
• 2.1 盐生植物盐芥的相关研究进展
• 2.1.1 盐芥——新型抗盐研究模式植物
• 2.1.2 盐芥相关分子生物学研究
• 2.2 植物过氧化物酶的研究进展
• 2.2.1 过氧化物酶的分类
• 2.2.2 植物过氧化物酶的活性
• 2.2.3 植物过氧化物酶的结构
• 2.2.4 植物过氧化物酶的功能
• 2.2.5 植物过氧化物酶基因的研究
• 2.3 基因全长克隆的策略及RACE技术
• 2.3.1 基因全长克隆的策略
• 2.3.2 RACE技术简介
• 2.3.3 SMART（switching mechanism at 5′-end of RNA Transcript）-RACE
• 第三章 ThPER42和ThPER32的克隆及序列分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料、E.coli菌株和感受态
• 3.1.2 质粒载体及涉及序列
• 3.1.3 工具酶、分子量标准及主要试剂盒
• 3.1.4 主要化学试剂
• 3.1.5 主要仪器、生物信息学软件及网址
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 植物材料处理方法
• 3.2.2 Trizol法提取总RNA
• 3.2.3 总RNA质量及浓度测定
• 3.2.4 cDNA第一链的合成
• 3.2.5 基因片段的克隆
• TM-RACE（Rapid amplification of cDNA Ends）方法'>3.2.6 SMART^TM-RACE（Rapid amplification of cDNA Ends）方法
• 3.2.7 PCR产物的回收及纯化
• 3.2.8 连接反应
• 3.2.9 超级感受态菌的制备
• 3.2.10 大肠杆菌转化及蓝白斑筛选方法
• 3.2.11 反应产物的琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.2.12 DNA序列测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 RNA质量检测
• 3.3.2 cDNA一链鉴定
• 3.3.3 ThPER42基因全长的获取及序列分析
• 3.3.4 ThPER32基因全长的获取及序列分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 ThPER42和ThPER32属于ClassⅢ过氧化物酶成员
• 3.4.2 盐芥cDNA的克隆
• 第四章、ThPER42和ThPER32的半定量RT-PCR分析
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 植物材料处理方法
• 4.2.2 Trizol法提取总RNA及质量、浓度测定
• 4.2.3 cDNA第一链的合成
• 4.2.4 指数扩增初期的确定及模板量的调整
• 4.2.5 ThPER42和ThPER32的PCR扩增
• 4.2.6 反应产物的琼脂糖凝胶电泳检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 RNA质量检测
• 4.3.2 指数扩增初期及模板量的确定
• 4.3.3 ThPER42和ThPER32的半定量分析
• 4.4 讨论及展望
• 第五章 ThPER42和ThPER32的原核表达载体构建
• 5.1 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 感受态细胞BL21的制备及转化
• 5.2.2 质粒提取
• 5.2.3 PCR产物的回收及纯化
• 5.2.4 重组原核表达载体pET30a-ThPER42的构建
• 5.2.5 重组原核表达载体pET30a-ThPER32的构建
• 5.2.6 目的蛋白的诱导表达及SDS-PAGE鉴定
• 5.3 结果及分析
• 5.3.1 重组原核表达载体pET30a-ThPER42的构建
• 5.3.2 重组原核表达载体pET30a-ThPER32的构建
• 5.4 讨论与展望
• 第六章 基本结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 致谢