抗植物病原真菌海洋黄杆菌及其活性物质研究

论文摘要

对危害严重并难以控制的农作物病原菌,急需寻找高效新靶标活性物质。在陆地寻找机率低的情况下,本研究从丰富而新颖的深海微生物资源中筛选出对农作物病原菌具有稳定拮抗作用的海洋黄杆菌WWP37（MCCC 1A01 368）,对其抗作物病原菌谱,抗菌物质的分离、纯化及初步鉴定,及其发酵条件进行了研究,结果如下:1.以水稻纹枯病、棉花枯萎病和油菜菌核病三类病原菌为指示菌株,对来自深海（2000-6000 m）及台湾海峡表面水的176株微生物进行了筛选,获得了11株具有稳定抗菌活性的细菌。其中黄杆菌属WWP37对10种作物病原真菌抗菌能力最强,该菌株连续转接10代抗菌活性稳定。2.理化性质的研究表明,抗菌活性物质能抵抗100℃的高温,且在pH4-10和紫外照射等环境中稳定。正丁醇萃取的粗提物,经薄层层析纯化,以抑制尖孢镰刀菌生长为指示对薄层层析板进行了生物显影,获得了Rf=0.35、Rf=0.56两条抑菌带,表明抗菌物质至少有两种活性组分;经Doskochilova溶剂系统纸层析验证,该物质与硫藤黄菌素的纸层析图谱极为相近。3.抗菌物质经有机溶剂萃取、凝胶层析（Sephadex LH-20）、固相萃取(C18 SPE)纯化,再经高效液相色谱（HPLC）分离、收集洗脱峰,检测其抑菌活性,证明组分BF-1活性较强,LC/MS测得其分子量为699 Da。紫外扫描显示,BF-1特征峰与硫藤黄菌素和金丝菌素特征吸收峰基本相同,初步确定BF-1为金丝菌素类抗生素。但BF-1只对病原真菌有抑制效果且分子量达到699 Da,却与现有金丝菌素类抗生素不同。因此,该物质极有可能是一种新抗生素,其结构鉴定正在进行中。4.对菌株WWP37的发酵正交试验证明,产抗菌活性物质的优化发酵培养基配方为:蔗糖0.6%、酵母粉1.2%、NaCl 1.4%、MgSO4 0.8%;优化培养条件为:500mL三角瓶装量100 mL、pH 8.0、培养温度为28℃、摇床转速200 r/min、种子发酵液菌龄8h,接种量为7.0%,培养时间为24 h。将发酵上清液稀释60倍后的的灌根处理接种油菜菌核病原菌的4-5片真叶的油菜幼苗21天后,防治效果可达76.7%。扫描电镜观察发现,对农作物病原菌（尖孢镰刀菌）的抑制作用表现为菌丝生长减慢,粗细不均且分支少,壁破裂,原生质泄漏。海洋黄杆菌群未见有产抗农作物病原真菌抗生素的研究,本文做了此方面的报道。BF-1初步确定为金丝菌素类抗生素,但其只对病原真菌有抑制效果且分子量达到699 Da,却与现有金丝菌素类抗生素不同,极有可能是一种新抗生素。到目前为止,还没有从海洋黄杆菌中筛选到的吡咯环类抗生素功能物质的相关报道。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 重要农作物病害生物防治的简况
• 1.3 海洋微生物活性物质的研究进展
• 1.3.1 海洋微生物抗菌活性物质
• 1.3.2 海洋微生物抗菌物质的种类
• 1.4 黄杆菌属细菌产生的活性物质
• 1.5 本课题的立题背景及研究目的
• 1.5.1 本课题的立题背景
• 1.5.2 本研究的目的与意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 海洋微生物菌种来源
• 2.2 植物病原菌
• 2.3 培养基
• 2.4 主要试剂和仪器
• 2.5 海洋微生物WWP37的筛选和培养
• 2.5.1 抗植物病原菌海洋微生物的筛选
• 2.5.2 抗菌谱测定
• 2.6 海洋黄杆菌WWP37稳定性研究
• 2.6.1 菌株WWP37传代稳定性测定
• 2.6.2 发酵液对温度稳定性测定
• 2.6.3 发酵液对酸碱稳定性测定
• 2.6.4 发酵液对紫外线稳定性测定
• 2.6.5 活性物质的萃取溶剂探讨
• 2.6.6 生物自显影薄层层析法
• 2.7 海洋黄杆菌WWP37摇瓶发酵条件的研究
• 2.7.1 种子液的制备
• 2.7.2 发酵液的制备
• 2.7.3 抗菌活性检测
• 2.7.4 菌株WWP37生长及活性物质的产生
• 2.7.5 发酵培养基的优化
• 2.7.6 发酵条件优化
• 2.7.7 二剂量法测定抗生素的相对效价
• 2.8 海洋黄杆菌WWP37活性物质分离纯化和鉴定研究
• 2.8.1 活性物质的产生
• 2.8.2 活性物质的萃取
• 2.8.3 Sephadex LH-20硅胶柱层析
• 2.8.4 固相萃取法
• 2.8.5 HPLC反相色谱
• 2.8.6 活性物质的Doskochilova系统纸层析
• 2.8.7 紫外吸收全扫描
• 2.8.8 LC/MS色谱
• 2.9 抗菌盆栽试验及抗菌作用的显微观察
• 2.9.1 供试植株
• 2.9.2 接种用病原菌孢子液的制备
• 2.9.3 发酵滤液对油菜菌核病的盆栽试验
• 2.9.4 发酵滤液对病原菌抗菌作用的显微观察
• 第三章 结果与分析
• 3.1 抗植物病原菌海洋微生物的筛选结果
• 3.1.1 抗植物病原真菌菌株
• 3.1.2 抗病原细菌菌株
• 3.1.3 抗菌谱的测定
• 3.2 海洋黄杆菌WWP37稳定性
• 3.2.1 菌株WWP37传代稳定性
• 3.2.2 菌株WWP37发酵液对温度的稳定性
• 3.2.3 菌株WWP37发酵液对光的稳定性
• 3.2.4 菌株WWP37发酵液对酸碱的稳定性
• 3.2.5 对有机溶剂敏感性
• 3.2.6 薄层层析试验结果
• 3.3 海洋黄杆菌WWP37摇瓶发酵条件的研究
• 3.3.1 菌株WWP37生长及活性物质的产生
• 3.3.2 发酵培养基的优化结果
• 3.3.3 发酵条件的优化结果
• 3.3.4 发酵优化前后发酵液抗菌活性的比较
• 3.3.5 抗生素相对效价的测定
• 3.4 活性物质分离纯化和鉴定
• 3.4.1 Sephadex LH-20硅胶柱层析
• 3.4.2 HPLC反相色谱柱
• 3.4.3 活性物质的Doskochilova系统纸层析
• 3.4.4 紫外光谱扫描与LC/MS分析
• 3.5 盆栽试验对油菜菌核病的防效及对抗菌作用的显微观察
• 3.5.1 发酵滤液对油菜菌核病的防效
• 3.5.2 发酵滤液对病原真菌抗菌作用的显微观察
• 第四章 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士在读期间待发表论文