两个ZmZF等位基因的分型及表达研究

论文摘要

在玉米不同自交系基因组间存在着丰富的SNPs（single nucleotidepolymorphisms）和InDels（insertion/deletion polymorphisms）,这为开发SNP分子标记、鉴别不同等位基因型提供了便利。目前已有多种检测SNP的方法,其中等位基因特异PCR（Allele-specific PCR,AS-PCR）是近年来开发的一种基于PCR技术的快速、简便、费用低廉的检测等位基因型的技术,但是因其特异引物3’端的第一个碱基有可能与模板错配从而影响了检测结果的可靠性。为了准确地检测玉米的等位基因型,可以根据玉米基因组丰富的SNPs和InDels设计同时包含多个SNP和InDel位点的等位基因特异PCR引物,这种引物可以克服单个SNP或InDel位点可能存在着错配的缺点来准确地检测玉米等位基因型,并进一步检测等位基因在杂交种中的表达情况。为了验证利用该方法是否可以方便、准确地检测玉米等位基因型,并检测等位基因在杂交种中的表达情况。本课题以一个淹水胁迫后在自交系Mo17和Hz32之间存在着表达差异的基因ZmZF为例来开展研究,旨在建立一种快捷准确的鉴别等位基因型以及检测等位基因在杂交种中表达的方法。研究结果如下:（1）根据已经公布的ZmZF基因cDNA序列设计的引物在两个亲本材料受水淹处理后的cDNA中扩增出了大部分ZmZF基因cDNA中的3’UTR和一小部分的编码区序列,在这两个部分序列间共包含了3个SNP位点和3个InDel位点。（2）根据等位基因特异PCR方法的原理,把SNP和InDel位点分别设计在正反分型引物中,然后用这些引物进行PCR,通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物来鉴别ZmZF-Mo17和ZmZF-Hz32基因型的cDNA模板。通过比较,初步筛选到了包含SNP位点的正向引物Pa、Pg和包含InDel位点的反向引物Ph、Pm能够准确地区分出这两种等位基因型。进一步地对这两对分型引物在不同Mg2+和dNTP浓度下的稳定性作了检测,发现这两对分型引物在一定浓度范围内都能稳定地区分这两种等位基因型。另外用实时荧光定量PCR方法检测也能够准确地鉴别出这两种等位基因型。这些结果说明结合了SNP和InDel位点的分型引物比只包含一个SNP位点的分型引物检测的准确性强,利用该引物可以快捷准确地进行玉米基因分型和等位基因在杂交种中的表达检测。（3）用分型引物做半定量RT-PCR检测ZmZF等位基因在杂交种以及两个亲本根系中的表达发现:在杂交种中与在亲本中一样,与0h的对照相比,在淹水胁迫后,ZmZF-Mo17表达量明显升高,而ZmZF-Hz32表达量比较稳定,并且比ZmZF-Mo17低。水淹8h后的不同材料的叶片用半定量RT-PCR检测发现这两个等位基因在叶片中的表达和根系中一样也存在着差异。用分型引物做实时荧光定量PCR检测后发现:两个等位基因在杂交种中的表达与在两亲本中一样存在着差异,但淹水胁迫24h后,在杂交种中ZmZF-Mo17的表达量较16h少。这些结果表明:在淹水胁迫下,玉米杂交种中也存在着等位基因表达的差异,这种差异性可能是由这两个基因Cis结构之间的差异引起的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 玉米基因组SNPs和InDels的研究进展
• 1.1.1 SNP和InDels的定义
• 1.1.2 玉米基因组的SNP和InDels出现频率
• 1.1.3 玉米基因组的SNP和InDels的应用
• 1.2 等位基因特异PCR检测技术的研究进展
• 1.2.1 等位基因特异PCR技术的原理
• 1.2.2 等位基因特异PCR技术目前存在的问题
• 1.2.3 实时荧光定量PCR技术检测SNP的原理
• 1.3 ZmZF与玉米根系在水胁迫条件下的表达调控
• 1.4 玉米杂种优势与基因表达及调控
• 1.5 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 ZmZF等位基因部分cDNA在两亲本间的多态性
• 2.2.1 玉米材料的淹水处理
• 2.2.2 玉米根系总RNA的提取和cDNA第一条单链的合成
• 2.2.3 ZmZF基因cDNA的部分序列扩增
• 2.2.4 PCR产物和T-载体连接
• 2.2.5 电转化
• 2.2.6 ZmZF基因cDNA部分序列的SNP和InDel的发掘
• 2.3 分型引物的设计和检测
• 2.3.1 分型引物的设计
• 2+浓度下的稳定性'>2.3.2 分型引物在不同Mg²⁺浓度下的稳定性
• 2.3.3 分型引物在不同dNTP浓度下的稳定性
• 2.3.4 基于分型引物的实时荧光定量PCR检测方法的建立
• 2.4 用分型引物对ZmZF等位基因表达的半定量RT-PCR检测
• 2.4.1 ZmZF等位基因在杂交种根系中的表达
• 2.4.2 ZmZF等位基因在杂交种叶片中的表达
• 2.5 实时荧光定量PCR检测这两个等位基因的表达
• 3 结果与分析
• 3.1 ZmZFcDNA序列在两亲本间的多态性
• 3.2 分型引物的筛选与特异位点的验证
• 3.3 分型引物稳定性的检验
• 2+浓度下的稳定性'>3.3.1 分型引物在不同Mg²⁺浓度下的稳定性
• 3.3.2 分型引物在不同dNTP浓度下的稳定性
• 3.4 实时荧光定量PCR方法鉴别这两个等位基因型的结果
• 3.5 ZmZF等位基因表达的半定量RT-PCR检测
• 3.5.1 ZmZF等位基因在根部的半定量RT-PCR检测
• 3.5.2 ZmZF等位基因在叶片中的表达
• 3.6 实时荧光定量PCR检测到的ZmZF等位基因在根系中的表达
• 3.6.1 ZmZF等位基因在杂交种根系中的表达
• 3.6.2 ZmZF等位基因在两亲本根系中的表达
• 4 讨论
• 4.1 本AS-PCR检测体系的探讨
• 4.1.1 本研究中特异引物的设计方法讨论
• 4.1.2 本AS-PCR反应体系对碱基错配的影响
• 4.1.3 PCR反应程序对本检测方法的影响
• 4.2 ZmZF等位基因的多态性与表达量的差异
• 4.2.1 开展玉米基因组转录因子多态性研究的意义
• 4.2.2 ZmZF等位基因的Cis结构多态性与表达差异之间的关系
• 4.2.3 ZmZF等位基因的表达差异与玉米的耐渍性
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录1 总RNA的提取
• 附录2 CASpure Gel Extraction Kit纯化回收DNA
• 附录3 电转化感受态的制备
• 附录4 扩增出的两条序列间的多态性
• 附录5 本研究中基因表达量的分析方法
• 附录6 在PCR反应结束后的相对定量分析程序