恶臭假单胞菌CD2 P型ATP酶基因cadA1抗Zn2+功能的确定

论文摘要

基因cadA1编码的是P型ATP酶，它是一种能够对细胞内重金属离子起到平衡调节作用的运输子。但是在恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）中，cadA1在抗重金属方面的功能还知道的很少。本研究的目的就是为了确定cadA1是否与P.putida CD2的重金属抗性相关。本研究构建了P.putida CD2的cadA1中断突变株，然后通过测定该突变株对不同重金属的抗性能力来研究cadA1的功能，将中断突变株对Cd2+、Zn2+、Co2+、Pb2+、Cu2+和Mn2+6种重金属的最小抑制浓度（MIC）进行了测定。结果显示，与野生型相比，MIC值并未有所变化。这表明了cadA1中断突变株与野生型对这6种重金属的抗性能力不存在差异。为了确定cadA1是否与重金属的抗性有关，也将cadA1在对重金属敏感的P.putida CD2突变株中进行了过量表达，观察细菌对重金属的抗性水平是否有提高。结果显示cadA1的过量表达能够提高P.putida CD2的czcCBA1突变株对Zn2+的抗性能力。这说明了CadA1能够提供对Zn2+的抗性，但这样一个结论却没有在cadA1的中断实验中得到证实。这给我们的启示是：cadA1在P.putida CD2中确实是有抗重金属的功能，但是它可能受到了细胞内某些因子的调控从而不能施展其自身的能力。本研究还利用绿色荧光蛋白测定的方法来初步研究了cadA1的表达调控。通过构建基因报告质粒pEGP-PCAD，然后利用它来监测恶臭假单胞菌中（野生型菌株，czcCBA1突变株，cadA2突变株）重金属对cadA1启动子的表达量的影响。结果显示cadA1启动子的表达只能够在P.putida CD2-2（也就是czcCBA1突变株）中被诱导，而且只被Zn2+诱导。这些也就说明了在P.putida CD2中，cadA1的表达只能被Zn2+诱导，而且CzcCBA1的存在会抑制这个诱导作用。结合上述三个方面的结果，最后确定了cadA1的功能：cadA1能够提供对Zn2+的抗性，但是它只是在P.putida CD2中，当czcCBA1发生了突变时才会大量合成蛋白CadA1，以此来作为细胞中的一个补救途径抵抗Zn2+。在一般情况下，由于CzcCBA1的存在，CadA1的量非常之小以至于它在细胞对重金属的解毒中根本起不到任何作用。据我们了解，本研究是第一次证明了在P.putida CD2中P型ATP酶基因cadA1与Zn2+的抗性有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1.1 重金属在生物体中的作用与毒害
• 1.1.1 微生物的生长代谢
• 1.1.2 重金属对微生物的毒害性
• 1.1.3 重金属对微生物产生毒性的原因
• 1.2 微生物对重金属的抗性机制
• 1.2.1 微生物对重金属的固定作用
• 1.2.2 微生物对重金属的转化作用
• 1.2.3 微生物对重金属的运输
• 1.2.4 微生物重金属抗性基因及其抗性机制
• 1.3 假单胞菌的金属抗性研究进展
• 1.4 本研究的目的与意义
• 第二章 P型ATP酶基因cadA1的中断
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 基因中断质粒的构建
• 2.3.2 恶臭假单胞菌CD2基因cadA1的中断
• 2.3.3 突变菌株P.putida CD2-1对金属的最小抑制浓度（MIC）的测定
• 2.4 小结
• 第三章 P型ATP酶基因cadA1的诱导表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 基因表达质粒的构建
• 3.3.2 P型ATP酶基因cadA1在恶臭假单胞菌中的过量表达
• 3.4 小结
• 第四章 P型ATP酶基因cadA1的表达调控
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 基因报告质粒的构建
• 4.3.2 恶臭假单胞菌CD2基因cadA1的表达调控研究
• 4.4 小结
• 第五章 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢