奶牛乳腺炎大肠杆菌curli菌毛基因的克隆、序列分析及载体构建

论文摘要

奶牛乳腺炎是奶牛的主要疾病之一,主要由病原微生物感染引起,由大肠杆菌引起的奶牛乳腺炎在高产奶牛中是很常见的,给奶牛业造成了巨大的经济损失。目前国内还缺少预防奶牛乳腺炎的效果较好的疫苗,我国众多奶牛养殖户在顽固性乳腺炎面前束手无策。针对以上问题,本课题在探索乳腺炎基因工程疫苗方面展开了研究。本研究分四部分如下:第一部分:奶牛乳腺炎大肠杆菌的分离鉴定对山东省内规模化奶牛场患乳腺炎的奶牛采样并进行大肠杆菌分离鉴定。本试验所建立的PCR方法与传统的细菌分离培养检测方法相比,减少了病原菌检测所需的时间和费用,并且敏感性和特异性都有所提高。这对于奶牛乳腺炎的防治有着重要的意义。第二部分奶牛乳腺炎大肠杆菌csgA基因的克隆、序列分析及载体构建CsgA蛋白是csgA的编码产物,又称为“curlin”约15-kDa,是组成curli菌毛的主要亚单位。利用PCR技术从大肠杆菌临床分离株扩增出编码csgA的基因,456bp片段,将csgA片段与pMD-18-T载体连接,经筛选和测序鉴定后,获得克隆菌。提取克隆菌质粒,经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后,回收csgA片段与pET32a载体连接,构建成该基因的原核表达质粒pET32a+/csgA,经PCR检测和双酶切检测证明,我们已经成功克隆csgA基因,并成功构建了pET32a+/csgA表达载体,这为进一步获得CsgA蛋白,并对其活性和功能的研究奠定了基础。第三部分奶牛乳腺炎大肠杆菌csgB基因的克隆、序列分析及载体构建CsgB蛋白是由csgB编码产生的,是组成curli菌毛的较小亚单位,其主要作用在CsgA分泌至细菌表面装配时作为聚合的核心,通过蛋白之间的交互作用导致CsgA蛋白构象的改变,聚合形成菌毛。此外,CsgB还是菌毛上的小分支的主要组分。利用PCR技术从大肠杆菌临床分离株扩增出编码csgB的基因,456bp片段,将csgB片段与pMD-18-T载体连接,经筛选和测序鉴定后,获得克隆菌。提取克隆菌质粒,经BamHⅠ、SalⅠ双酶切后,回收csgB片段与pET32a载体连接,构建成该基因的原核表达质粒pET32a+/csgB,经PCR检测和双酶切检测证明,我们已经成功克隆csgB基因,并成功构建了pET32a+/csgB表达载体,这为进一步获得CsgB蛋白,并对其活性和功能的研究奠定了基础。第四部分奶牛乳腺炎大肠杆菌csgC基因的克隆、序列分析及载体构建CsgC以成熟的形式集合在周间质,对CsgA细胞外的组装是很重要的,能够促进curli的合成。利用PCR技术从大肠杆菌临床分离株扩增出编码csgC的基因,333bp片段,将csgC片段与pMD-18-T载体连接,经筛选和测序鉴定后,获得克隆菌。提取克隆菌质粒,经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后,回收csgC片段与pET32a载体连接,构建成该基因的原核表达质粒pET32a+/csgC,经PCR检测和双酶切检测证明,我们已经成功克隆csgC基因,并成功构建了pET32a+/csgC表达载体,这为进一步获得CsgC蛋白,并对其活性和功能的研究奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1 奶牛乳腺炎及其危害
• 1.1 奶牛乳腺炎的危害
• 1.2 奶牛乳腺炎的病原菌及其影响因素
• 1.3 病原微生物向乳房内的侵入机制
• 1.4 乳腺的防御系统
• 1.4.1 乳腺的物理防御系统
• 1.4.2 乳腺的细胞免疫机制
• 1.4.3 牛奶中的免疫球蛋白
• 1.4.4 体液免疫机制
• 1.5 乳腺炎的症状和分类
• 1.6 乳腺炎的监测与诊断
• 1.6.1 体细胞计数法
• 1.6.2 化验检验法
• 1.6.3 物理检验法
• 1.7 乳腺炎的治疗研究现状
• 1.7.1 临床型乳腺炎
• 1.7.1.1 抗生素治疗
• 1.7.1.2 重组牛γ-干扰素（rboIFN-γ）
• 1.7.1.3 抗奶牛乳腺炎病原菌复合卵黄抗体（IgY）
• 2 大肠杆菌Curli 菌毛的生物学特性及其研究进展
• 2.1 Curli 菌毛的形成机理
• 2.2 Curli 菌毛的编码基因及其编码的蛋白
• 2.3 Curli 菌毛引起奶牛乳腺炎的致病机理
• 2.4 curli 菌毛的研究展望
• 3 本试验研究的目的意义
• 材料与方法
• 1 试验材料
• 1.1 实验样本
• 1.2 质粒和受体菌
• 1.3 基因克隆相关试剂
• 1.4 试剂盒
• 2 主要试验仪器
• 3 试验方法
• 3.1 纯化回收DNA 片段
• 3.2 PCR 产物的连接 T 载体
• 3.3 感受态细胞的制备
• 3.4 连接产物的转化
• 3.5 质粒提取
• 3.6 重组质粒的酶切回收
• 3.7 表达载体的酶切回收
• 3.8 目的片段与表达载体的连接
• 实验一 奶牛乳腺炎大肠杆菌的分离与鉴定
• 1 实验材料
• 1.1 培养基
• 1.2 样品
• 1.3 实验菌株
• 2 实验步骤
• 2.1 采集奶样
• 2.2 制备伊红美兰平板
• 2.3 涂板培养
• 2.4 纯化
• 2.5 液体培养，提取基因组 DNA
• 2.6 PCR 扩增特异片断
• 3 实验结果
• 3.1 引物特异性检测
• 3.2 大肠杆菌临床分离株鉴定的部分电泳图片
• 4 讨论
• 实验二 奶牛乳腺炎大肠杆菌csgA 基因的克隆、序列分析及载体构建
• 1 材料和方法
• 1.1 菌种、载体、工具酶和主要试剂
• 1.2 引物设计
• 1.3 基因组 DNA 的提取
• 1.4 PCR 反应循环条件
• 1.5 DNA 琼脂糖凝胶电泳
• 1.6 csgA 基因重组克隆质粒的构建
• 1.7 csgA 序列分析
• 1.8 CsgA 蛋白结构预测
• 1.9 大肠杆菌csgA 基因重组表达质粒的构建
• 2 结果
• 2.1 PCR 产物分析
• 2.2 重组克隆质粒的构建与鉴定
• 2.3 序列分析
• 2.4 CsgA 蛋白的二级结构预测
• 2.5 CsgA 蛋白的结构域分析
• 2.6 重组表达质粒的构建与鉴定
• 3 讨论
• 实验三 奶牛乳腺炎大肠杆菌csgB 基因的克隆、序列分析及载体构建
• 1 材料和方法
• 1.1 菌种、载体、工具酶和主要试剂
• 1.2 引物设计
• 1.3 基因组 DNA 的提取
• 1.4 PCR 反应循环条件
• 1.5 DNA 琼脂糖凝胶电泳
• 1.6 csgB 基因重组克隆质粒的构建
• 1.7 csgB 序列分析
• 1.8 CsgB 蛋白结构预测
• 1.9 大肠杆菌csgB 基因重组表达质粒的构建
• 2 结果
• 2.1 PCR 产物分析
• 2.2 重组克隆质粒的构建与鉴定
• 2.3 序列分析
• 2.4 CsgB 蛋白的二级结构预测
• 2.5 CsgB 蛋白的结构域分析
• 2.6 重组表达质粒的构建与鉴定
• 3 讨论
• 实验四 奶牛乳腺炎大肠杆菌csgC 基因的克隆、序列分析及载体构建
• 1 材料和方法
• 1.1 菌种、载体、工具酶和主要试剂
• 1.2 引物设计
• 1.3 基因组 DNA 的提取
• 1.4 PCR 反应循环条件
• 1.5 DNA 琼脂糖凝胶电泳
• 1.6 csgC 基因重组克隆质粒的构建
• 1.7 csgC 序列分析
• 1.8 CsgC 蛋白结构预测
• 1.9 大肠杆菌csgC 基因重组表达质粒的构建
• 2 结果
• 2.1 PCR 产物分析
• 2.2 重组克隆质粒的构建与鉴定
• 2.3 序列分析
• 2.4 CsgC 蛋白的二级结构预测
• 2.5 CsgC 蛋白的结构域分析
• 2.6 重组表达质粒的构建与鉴定
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文