芍药苷对急性缺氧大鼠前扣带回锥体神经元的影响

论文摘要

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE）是发生于新生儿围产期的一种常见疾病,主要是由围产期窒息引发的脑组织缺氧缺血性损害,以脑组织出现水肿、坏死等症状为主要临床表现。HIE严重威胁新生儿生命,致残率较高,可导致运动功能障碍、智力障碍、脑瘫等神经系统损伤后遗症。研究HIE的预防措施和保护性治疗药物,有重要的社会意义和临床价值。脑组织的能量来源几乎全部是有氧糖代谢,而脑内的糖原又很少,脑代谢所需要的葡萄糖和氧全靠脑部血液循环供应。新生儿的脑代谢十分旺盛,耗氧量几乎是全身耗氧量的一半,缺氧最先影响到脑组织的正常代谢。缺氧是HIE的主要病理基础,可引起神经元的坏死和脑水肿。前扣带回（anterior cingulate cortex,ACC）是边缘系统的一部分,属于原皮质和旧皮质。ACC具有重要的情感调节和高等认知（学习、记忆等）作用,被称为执行功能的神经基础。缺氧缺血可导致ACC锥体细胞核固缩或焦油深染,出现脑水肿和神经元死亡的形态表现,结果引起临床语言障碍、偏瘫等神经系统损伤后遗症。芍药为毛茛科植物,性微寒,味苦酸,归肝脾经。《神农本草经》记载:“主邪气腹痛,除血痹,破坚积寒热,疝瘕,止痛,利小便,益气”。中医方剂中,芍药能与多种中药配伍,发挥不同的作用。现代药理学研究表明芍药苷（paeoniflorin,PF）是芍药的重要生物活性物质,它具有降低血液黏度、改善微循环、扩张血管、降压、解痉镇痛、抗惊等作用。动物实验研究还证实了芍药苷能通过抑制胞内钙超载,阻断钠通道,抑制细胞的凋亡,具有抗兴奋性氨基酸（excitatory amino acid,EAA）毒性、抗氧化等作用,可发挥神经保护作用。上述研究成果提示,HIE患儿出现运动功能障碍、智力障碍、脑瘫等神经系统损伤后遗症,尤其认知障碍,是由于缺氧导致ACC锥体神经元的损伤所致。那么,PF是否能够通过对ACC锥体神经元的保护作用,恢复受损伤神经元的正常功能,进而达到治疗HIE的目的,尚需进一步的实验研究加以证实。有鉴于此,本实验以正常幼年SD大鼠ACC锥体神经元为研究对象,用95%N2/5%CO2建立急性缺氧脑片模型;采用红外可视全细胞膜片钳技术,记录急性缺氧对ACC锥体神经元微小兴奋性突触后电流（miniature excitatory postsynaptic current,mEPSC）的影响及PF对急性缺氧后ACC锥体神经元mEPSC的作用。本实验重点在于研究PF对急性缺氧脑损伤后ACC锥体神经元mEPSC的影响,以进一步探讨PF的神经保护作用机制。研究内容实验一:应用红外可视全细胞膜片钳技术记录ACC锥体神经元的电生理特性应用红外可视全细胞膜片钳技术,观察和分析健康幼年SD大鼠ACC锥体神经元的形态结构和基本电生理特性,确定所记录的神经元。实验二:急性缺氧对离体幼年大鼠ACC锥体神经元mEPSC的影响应用脑片全细胞膜片钳技术记录ACC锥体神经元正常状态及急性缺氧状态下的mEPSC,观察急性缺氧对ACC锥体神经元的影响。实验三:PF对急性缺氧ACC锥体神经元的作用急性缺氧5～6min后,采用脑片全细胞膜片钳技术,通过灌流含有PF（300μmol/L）的正常人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid,ACSF）,记录ACC锥体神经元的mEPSC的变化。观察PF对大鼠急性缺氧ACC锥体神经元mEPSC的影响,探讨PF的神经保护作用。研究结果1.通过红外可视全细胞膜片钳技术,我们清楚的观察到ACC锥体神经元的形态结构,该区锥体细胞排列整齐,胞体呈锥形或三角形,边界清楚。依据所记录动作电位的不同特征,ACC锥体神经元可以分为三类:第一类是RS（regular spiking cell）神经元（54.1%）,它的动作电位的特征是单个动作电位后伴随有一个明显的后超极化。第二类是IB（intrinsic bursting cell）神经元（29.7%）,它的动作电位特征是单个动作电位后有一个后超极化和一个大的后去极化,并产生一个突发的动作电位。第三类是IM （intermediate cell）神经元（16.2%）,它是以单个动作电位后有一个后超极化和一个小的后去极化（小于2mV）。2.在急性缺氧后,我们观察到ACC锥体神经元的mEPSC个数与幅度比正常状态下增加,mEPSC的个数从正常状态的33.14±0.46增加到38.52±0.44（n=10,P<0.01）。而mEPSC的频率也明显从正常状态的（3.31±0.06）Hz增加到（3.85±0.06）Hz（n=10,P<0.01）。3.急性缺氧5～6min后,灌流含有PF（300μmol/L）的正常ACSF,ACC锥体神经元的mEPSC个数与幅度比急性缺氧后减少,mEPSC的个数从38.52±0.44减少到30.66±0.49（n=10,P<0.05）。且mEPSC的频率从（3.85±0.06）Hz减少为（3.07±0.06）Hz（n=10,P<0.05）。研究结论1.ACC锥体神经元依据放电模式的不同,区分为三种类型神经元,证实ACC锥体神经元具有多样性特征。2.通过记录ACC锥体神经元mEPSC频率的变化,证实了急性缺氧对ACC锥体神经元的损伤作用。3.证实了PF可能通过抑制急性缺氧ACC锥体神经元mEPSC的频率,调节突触活动的可塑性变化,发挥神经保护作用。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 1 中医学和现代医学对脑的认识
• 2 脑损伤的病理机制研究
• 3 前扣带回与 HIBD 的关系
• 4 HIBD 与兴奋性神经递质的释放
• 5 中药脑神经保护作用的实验研究
• 6 中医对芍药的认识
• 7 芍药的现代化研究
• 实验一 应用红外可视显微镜观察大鼠ACC 神经元的电生理特征
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 急性缺氧对ACC 锥体神经元的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 芍药苷对急性缺氧ACC 锥体神经元的作用
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢