灵芝多糖对H22荷瘤小鼠肠道黏膜免疫功能的影响

论文摘要

中医理论认为正气内虚是肿瘤发生的重要基础,因此扶正培本是肿瘤治疗的重要法则,由于扶正培本药物亦可明显减轻化疗引起的毒副反应,因而被广泛应用于肿瘤及肿瘤化疗后的治疗。灵芝具有养心安神、补气益血、补肺平喘、滋补强壮、扶正培本、延年益寿等功效。现代研究表明,灵芝具有多种生物活性成分,而研究最早、最为深入、功能也最为复杂的是灵芝多糖（Ganoderma Lucidum Polysaccharides,GLP）。GLP具有明显的抗肿瘤及免疫调节作用,因此被认为是灵芝扶正培本的主要成份。研究表明GLP分子中能够产生上述生理活性的结构是含β-（1,3）键的葡聚糖,然而从现有的研究报道可知,机体是很难在胃肠道内酶解含β-（1,3）键的多糖,也即是说口服GLP将难以被机体消化,但长期临床和动物实验均证明口服GLP具有明显的免疫调节及抗肿瘤作用。因此我们推测GLP可能通过调节肠道黏膜免疫功能而激发机体的免疫调节及抗肿瘤作用。据此,本课题在中医理论的指导下,应用流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）、免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）、酶联免疫（Enzyme LinkedImmunosorbent Assay,ELISA）、酶联免疫斑点（Enzyme-Linked Immunospot Assay,ELISPOT）及逆转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction,RT-PCR）等技术,从整体、细胞、分子水平,首次将GLP对荷瘤机体肠道黏膜免疫功能的影响进行了深入的研究。通过体内实验与体外实验两方面进行研究与探讨,结果表明:一GLP对体外培养的H22细胞具有明显的抑制作用,且能促进肠道黏膜淋巴细胞的增殖与分泌1采用MTT法观察GLP对体外培养H22细胞生长的影响,发现GLP对H22细胞具有直接的杀伤作用,且与药物浓度及作用时间成正相关,随着药物浓度的增加、作用时间的延长,细胞毒作用明显增强。加药72 h后,500μg/ml GLP对H22细胞的抑制率为47.97%。2通过ELISPOT方法检测GLP对外周血单个核细胞（PBMC）及PP结淋巴细胞（PPL）分泌细胞因子的影响,结果发现各浓度GLP均能刺激PBMC分泌IL-2,但是对PPL却没有直接的刺激作用。采用MTT法发现在ConA协同作用下,GLP不仅能刺激PBMC增殖,且能刺激上皮内淋巴细胞（IEL）与PPL增殖,通过ELISA法检测其上清,显示GLP均能明显增加PBMC、IEL、PPL对IL-2与IL-10的分泌,RT-PCR结果也显示TNF-α与IL-10 mRNA的表达相应增加,并发现GLP在62.5μg/ml、125μg/ml时,淋巴细胞对IL-2、IL-10与TNF-α基因及蛋白的表达最强,但不具有剂量依赖性。二体内实验发现GLP能调节H22荷瘤小鼠肠道黏膜免疫功能1本研究结果显示,环磷酰胺（CTX）、GLP、CTX+GLP均能显著抑制肿瘤的生长,抑瘤率分别为78.12%、38.64%、78.53%。通过对体重的观察发现,模型组与正常组相比,无显著差异;CTX组、CTX+GLP组与模型组比较,体重明显降低,但CTX组与CTX+GLP组相比较无显著性差异。可见在此荷瘤小鼠模型中,GLP未显示出对CTX的协同增效作用,并且不能抑制CTX所致的体重减轻。但是通过对小鼠毛色进行观察发现,CTX+GLP组小鼠毛色光亮、行动灵敏,明显强于CTX组,说明GLP能部分调整CTX所致的副作用,从现有结果推测,随着给药时间的延长,GLP可能会抑制CTX所致的体重减轻。2采用流式细胞术观察PBMC、IEL、LPL、PPL各T淋巴细胞亚群的变化,发现H22荷瘤小鼠存在着黏膜免疫与系统免疫的变化。结果显示,荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞亚群（CD3+T淋巴细胞）有下降趋势,CD4+T淋巴细胞亚群显著下降,而CD8+T淋巴细胞亚群变化无显著性差异,导致CD4/CD8比值显著下降。与正常组比较,H22荷瘤小鼠IEL中CD4+T淋巴细胞亚群明显上升,CD8+T淋巴细胞亚群无明显变化,从而引起CD4/CD8比值明显上升。在肝癌小鼠PPL中各细胞亚群与正常组比较未见明显差异。在H22荷瘤小鼠模型中,与正常组比较,LPL CD3+T淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞亚群变化无显著性差异,而CD8+T淋巴细胞亚群明显上升,导致CD4/CD8比值明显下降。ELISA法对外周血的检测发现,血清中IL-10含量明显升高,IL-2含量明显降低。免疫组化结果显示:模型组IgA、IL-2及TNF-α分泌明显减少,IL-10明显增加,与正常组相比,差异具有显著性。以上结果均反映出H22荷瘤小鼠机体处于一种免疫抑制状态。同时注意到此肿瘤模型不同部位的肠道黏膜淋巴细胞（IEL、LPL、PPL）变化表现不一,分析原因可能由于各淋巴细胞在肠道黏膜中的部位不同,接触抗原的先后及成份不同,因而使其形成了不同表型及免疫功能。3目前关于GLP对肿瘤机体肠道黏膜免疫系统的研究未见报道,本课题对此进行了初探,这也是本实验的创新点。采用流式细胞术方法检测T淋巴细胞亚群发现,CTX能明显升高PPL中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞比例,降低CD4/CD8比值。GLP组与模型组相比,无显著性差异,但是其能降低由CTX导致的CD3+和CD8+T淋巴细胞亚群显著升高,抑制CD4/CD8的比值明显增加的趋势。CTX、GLP、CTX+GLP组中IEL CD3+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞亚群与模型组相比,无统计学意义,其主要变化在CD4+T淋巴细胞。CTX使IEL中的CD4+T淋巴细胞的比例显著下降,CD4/CD8比值相应也显著降低。GLP亦能使IEL中的CD4+T淋巴细胞的比例及CD4/CD8比值显著下降,且对CTX所致的CD4+T淋巴细胞降低有提高的趋势,但无统计学意义。这个结果与外周血的结果完全不同,这可能与IEL的免疫功能有关,具体的机理尚有待进一步探讨。与模型组相比,CTX使LPL中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞明显下降,但是CD4/CD8比值却明显升高;GLP对CD3+和CD4+T淋巴细胞无明显变化,但是由于CD8+T淋巴细胞比例下降,导致CD4/CD8比值明显上升。GLP能提高CTX诱导的CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞的降低,表明GLP能改善CTX导致的免疫功能低下。固有层中T淋巴细胞的主要功能是辅助B淋巴细胞合成和分泌IgA,这种辅助作用是通过T辅助细胞分泌细胞因子实现的。本实验观察到CTX使荷瘤小鼠IgA明显降低,GLP能提高荷瘤小鼠IgA的表达（与正常组比较,P=0.07）,并抑制CTX引起IgA的下降（P＜0.05）。采用IHC方法检测肠道内IL-2、IL-10、TNF-α的表达,发现CTX与GLP均能下调IL-10水平;CTX可以显著提高荷瘤小鼠IL-2及TNF-α的水平,GLP对荷瘤小鼠IL-2及TNF-α的降低亦有提高作用,并对CTX有协同增效的趋势。以上结果说明GLP可能通过调节荷瘤小鼠及CTX化疗后小鼠Th1/Th2型细胞因子的比例,提高Th1型细胞因子,增强机体的免疫功能而发挥作用。GLP对荷瘤小鼠及化疗后小鼠众多肠道黏膜免疫特征的影响作用,证实了我们的推测,即GLP可能通过影响肠道黏膜免疫功能而激发全身免疫系统而发挥抗肿瘤的作用。综上所述,扶正培本中药灵芝的提取物GLP能抑制荷瘤小鼠肿瘤生长,并对CTX引起的副作用有部分调整作用。其作用机制之一是GLP通过某种方式刺激肠道黏膜淋巴细胞,肠道黏膜淋巴细胞通过淋巴细胞再循环,进而激活全身免疫系统而发挥抗肿瘤的作用。这一结果表明,GLP是灵芝扶正培本药效的物质基础之一,同时也提示临床采用灵芝及扶正培本疗法治疗肿瘤的机制可能与调整机体的肠道黏膜免疫功能有关。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语
• 综述 中医药对肠道黏膜免疫系统调节作用的研究进展
• 前言
• 第一部分 灵芝多糖对体外培养的H22细胞及淋巴细胞的影响
• 1 材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 主要试剂及配制
• 1.2.1 主要试剂
• 1.2.2 液体制备
• 1.3 主要仪器及耗材
• 2 方法
• 2.1 GLRP对H22细胞增殖功能的检测
• 2.2 GLRP对小鼠淋巴细胞功能的检测
• 2.2.1 淋巴细胞的分离
• 2.2.2 GLRP对PBMC、PPL分泌IL-2的检测
• 2.2.3 GLRP对Con A诱导的PBMC、PPL及IEL增殖功能的检测
• 2.2.4 GLRP对Con A诱导的PBMC、PPL及IEL分泌IL-2和IL-10的检测
• 2.2.4.1 样品的制备
• 2.2.4.2 IL-2含量的检测
• 2.2.4.3 IL-10含量的检测
• 2.2.5 GLRP对Con A诱导的PBMC、PPL TNF-α和IL-10 mRNA表达的检测
• 2.3 统计分析
• 3 结果
• 3.1 GLRP对H22细胞生长的影响
• 3.2 小肠黏膜淋巴细胞的提取
• 3.2.1 小肠黏膜的解离程度
• 3.2.2 淋巴细胞的获取数量及活力
• 3.3 GLRP对淋巴细胞（PBMC、PPL）分泌IL-2的影响
• 3.4 GLRP对ConA诱导的淋巴细胞（PBMC、PPL、IEL）增殖功能的影响
• 3.5 GLRP对ConA诱导的淋巴细胞（PBMC、PPL、IEL）分泌IL-2与IL-10的影响
• 3.6 GLRP对ConA诱导的淋巴细胞（PBMC、PPL）IL-10与TNF-αmRNA表达的影响
• 4 讨论
• 5 小结
• 第二部分 灵芝多糖对H22荷瘤小鼠肠道黏膜免疫功能的影响
• 1 材料
• 1.1 动物
• 1.2 主要试剂及配制
• 2 方法
• 2.1 动物模型及分组
• 2.2 给药方法
• 2.3 取材
• 2.4 检测指标及方法
• 2.4.1 各组小鼠体重的变化及肿瘤抑制率的计算
• 2.4.2 各组小鼠T淋巴绌胞CD3、CD4及CD8亚群的检测
• 2.4.3 各组小鼠外周血IL-2与IL-10的检测
• 2.4.4 各组小鼠小肠IL-2、IL-10、TNF-α及IgA表达的检测
• 2.4.4.1 免疫组化染色方法检测小肠IL-2、IL-10及TNF-α的表达
• 2.4.4.2 免疫组化染色方法检测小肠IgA的表达
• 3 结果
• 3.1 GLCP对昆明小鼠H22实体瘤的抑制作用
• 3.2 GLCP对昆明小鼠体重及毛色的影响
• 3.3 GLCP对荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响
• 3.4 GLCP对荷瘤小鼠IEL中T淋巴细胞亚群的影响
• 3.5 GLCP对荷瘤小鼠PPL中T淋巴细胞亚群的影响
• 3.6 GLCP对荷瘤小鼠LPL中T淋巴细胞亚群的影响
• 3.7 GLCP对荷瘤小鼠外周血IL-10与IL-2含量的影响
• 3.8 GLCP对荷瘤小鼠小肠IgA、IL-2、IL-10及TNF-α表达的影响
• 4 讨论
• 4.1 药物选择
• 4.2 动物模型的选择
• 4.3 肠道黏膜免疫在机体免疫系统中的作用
• 4.4 肠道黏膜免疫与肝癌的关系
• 4.5 灵芝多糖对H22荷瘤小鼠肠道黏膜免疫功能的影响
• 5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 附图