论文摘要
淋巴囊肿病毒（Lymphocystis disease virus, LCDV）,属于虹彩病毒科（Iridoviridae）,淋巴囊肿病毒属（Lymphocystivirus）,其分布遍及全球;能引起9个目34科计140种以上淡、海水鱼的淋巴囊肿病,在淡、海水鱼组织细胞中可以增殖并引起宿主细胞病变,在病鱼体表等处形成囊肿物。该病毒病在发病的养殖场的感染率可达90%以上,病鱼不仅外形丑陋,且会发生死亡,严重影响了商品价值和市场销售。1962年,Walker首次在鲽形目鱼类中发现淋巴囊肿病的病原,并命名为淋巴囊肿病毒（LCDV）;1997年Tidona等测得了LCDV-1的全基因组序列,报告LCDV-1基因组长102653 bp、编码195个ORF。在中国,1997年底首次在威海地区呈亚急性暴发;1998年,孙修勤等从患病养殖牙鲆体内首次分离出淋巴囊肿病毒、称之为淋巴囊肿病毒中国分离株LCDV-cn,并开始对淋巴囊肿病毒进行了系统的研究。2000年,徐洪涛等获得了LCDV-cn mcp基因的部分序列,认为LCDV-cn的mcp基因序列与LCDV-1的mcp基因序列的同源性为78%。2004年,张奇亚等LCDV-C的全基因组序列,认为基因组长186250 bp、编码240个ORF。本文以LCDV-cn核衣壳蛋白基因（mcp）为分子标记,通过PCR扩增和克隆测序获得了长度为1356 bp的、含178个信息位点的mcp基因序列;用最大简约法、最大似然法、邻接法和Bayesian法构建了分子系统树并进行了置信度检验,从DNA水平上分析了LCDV-cn与淋巴囊肿病毒韩国鲈鱼分离株（LCDV- sb）、淋巴囊肿病毒日本牙鲆分离株（LCDV-jf）、淋巴囊肿病毒欧洲分离株（LCDV-1）、淋巴囊肿病毒日本岩鱼分离株（LCDV-rf）及淋巴囊肿病毒中国军曹鱼分离株（LCDV-rc）的系统关系。结果表明,LCDV-cn的mcp基因序列与LCDV-C的mcp基因序列是一致的,构建的淋巴囊肿病毒ML、NJ、MP和Bayesian系统树的拓扑结构也一致,LCDV-rc与LCDV-sb聚为一支;LCDV-cn与LCDV-jf聚为一支;LCDV-1独为一支;LCDV-rf也独为一支。在对35种虹彩病毒的系统关系分析中,LCDV-cn与其他淋巴囊肿病毒分离株聚为一大支,说明LCDV-cn与淋巴囊肿病毒的关系近于其他虹彩病毒。遗传距离和系统关系分析认为,LCDV-1属于基因型Ⅰ型,LCDV-cn和LCDV-jf属于基因型Ⅱ型,LCDV-rf属于基因型Ⅲ型,LCDV-rc和LCDV-sb属于基因型Ⅳ型。本研究经PCR扩增、克隆和测序,证明了获得的11个LCDV-cn的基因DNA序列与已登陆的LCDV-C相应序列一致。据此,本研究以LCDV-C基因组序列为参考序列进行分析,结果表明,LCDV-cn基因组中有119个ORF与其它虹彩病毒无同源区域、是LCDV特有的;而LCDV-cn还有52个自身特有的、含有功能结构或重复序列的ORF,该52个ORF与其他淋巴囊肿病毒和LCDV无同源区域。锌指蛋白在基因的表达调控、细胞分化、胚胎发育及疾病的发生等生命过程中发挥重要作用。本文通过PCR法从LCDV-cn基因组DNA中获得了锌指蛋白基因序列,将DNA序列装入pET24a（+）表达载体,在E.coli中进行蛋白表达并获得成功。生物信息学软件分析表明:lcn61编码的锌指蛋白含有4个C2H2型锌指结构域,lcn140编码的锌指蛋白含有4个C3H1型锌指结构域和4个简单重复序列。LCDV-cn锌指蛋白的研究将有助于进一步了解LCDV的发生与发展,为阐明病毒致病的分子机理提供科学依据。迄今,病毒DNA疫苗在抗病毒性疾病上取得了很大成功,但在抑制病毒编码功能蛋白时却可能影响宿主细胞内的功能蛋白。RNAi是一种新型基因沉默方法,已成功应用于多种生物体和组织细胞的基因功能研究。有文献报道,RNAi也存在于海洋生物中、并在海洋生物功能基因等研究中得到应用。本文根据LCDV-cn和LCDV的特有基因序列设计siRNA,将siRNA注射入牙鲆体内,首次研究了RNAi对LCDV-cn基因表达的影响,结果发现,注射mcp-siRNA1和mcp-siRNA3后,LCDV-cn的mcp基因表达量有所减少,说明LCDV的mcp基因在RNAi技术处理后有所抑制。