巴西橡胶树HbMyb1基因和OPV-10390连锁标记原位PCR定位的研究

论文摘要

本研究采用原位PCR技术对橡胶树死皮病抗性相关HbMyb1基因和抗白粉病基因连锁标记OPV-10390进行了物理定位,结果如下:成功地建立了橡胶树染色体原位PCR技术体系。该原位扩增的PCR反应液总体积为50μl,各反应组分的终浓度为:1×buffer,4.5 mM MgCl2,0.5 mg/ml BSA,200μM的dATP、dCTP、dGTP,72μM的dTTP,4μM DIG-11-dUTP,5U/5μl的Taq DNA聚合酶,2.4μM的Primer;原位PCR扩增程序为:95℃预变性后进行20个循环反应,94℃变性30S,53℃（视引物Tm值）退火1min,72℃延伸70S,最后72℃继续延伸7min;扩增后的洗脱为0.1×PBS 4～5 min,0.1×SSC/（吐温20）2×5min。利用本研究所建立的原位PCR技术,首次对橡胶死皮病抗性相关HbMyb1基因和抗白粉病基因连锁标记OPV-10390进行了染色体定位。在热研7-33-97和RRIM600叶片细胞不同分裂时期均扩增到1～2个信号。橡胶HbMyb1基因初步定位于7-33-97的第5号染色体长臂上,信号位点到着丝粒的百分距离为15.21。橡胶抗OPV-10390初步定位于RRIM600的第8号染色体长臂及11号染色体短臂上,信号位点到着丝粒的百分距离分别是16.99、49.58。对热研7-33-97（RRIM600×PR107）和橡胶栽培品系RRIM600进行了核型分析。热研7-33-97的核型公式为2n=36=34m（4sat）+2sm,第15号染色体为亚中部着丝点染色体（sm）,其余17对染色体为中部着丝点染色体（m）,第6、7号染色体短臂具有随体,染色体绝对长度变化范围为3.14～6.36μm,相对长度为3.67%～7.44%,平均臂比为1.44,核型属2B型。RRIM600核型公式为2n=36=28m（4sat）+8sm,第11号、12号、14号及17号染色体为亚中部着丝点染色体（sm）,其余14对染色体为中部着丝点染色体（m）,第6、7号染色体短臂具有随体,染色体绝对长度变化范围为3.92～8.47μm,相对长度为3.45%～7.47%,平均臂比为1.60,核型属2B型。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 橡胶树种质概述
• 1.2 橡胶树抗性相关基因研究概况
• 1.2.1 死皮病抗性相关基因（HbMybl）
• 1.2.2 含锰的超氧化物歧化酶基因（MnSOD）
• 1.2.3 几丁质酶基因（Chitinase）
• 390)'>1.2.4 抗白粉病基因连锁标记(OPV-10₃₉₀)
• 1.3 橡胶树基因定位研究进展
• 1.4 橡胶树的核型分析
• 1.5 植物原位PCR的研究进展
• 1.5.1 原位PCR的基本原理
• 1.5.2 植物原位PCR技术的主要操作步骤
• 1.5.3 植物原位PCR应用进展
• 1.6 本研究的目的意义和技术路线
• 1.6.1 研究目的及意义
• 1.6.2 研究的技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料与试剂
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 主要的仪器
• 2.1.3 试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 橡胶树DNA提取
• 2.2.2 特异引物合成与筛选
• 2.2.3 橡胶树特异DNA序列的原位PCR检测体系
• 2.2.3.1 PLL（L—多聚赖氨酸）包被玻片
• 2.2.3.2 染色体标本制备
• 2.2.3.3 预处理
• 2.2.3.4 原位扩增
• 2.2.3.5 荧光检测结果
• 390的定位'>2.2.3.6 橡胶死皮病抗性相关基因HbMybl和抗白粉病基因连锁标记OPV—10₃₉₀的定位
• 3 结果与分析
• 390特异引物的筛选'>3.1 OPV-10₃₉₀特异引物的筛选
• 3.1.1 橡胶树基因组DNA的提取
• 3.1.2 橡胶树特异引物的合成与筛选
• 3.2 橡胶树染色体的原位PCR技术体系的建立
• 3.2.1 标本预理的优化
• 3.2.2 原位扩增体系的建立
• 3.2.3 扩增后洗脱的优化
• 390的原位PCR定位'>3.3 橡胶树HbMybl和OPV—10₃₉₀的原位PCR定位
• 3.3.1 核型分析
• 3.3.2.HbMybl在热研7-33-97叶片细胞不同分裂时期原位PCR及其染色体上的定位分析
• 390在RRIM600叶片细胞不同分裂时期原位PCR及其染色体上的定位分析'>3.3.3 OPV—10₃₉₀在RRIM600叶片细胞不同分裂时期原位PCR及其染色体上的定位分析
• 4 讨论
• 4.1 引物的筛选
• 4.2 染色体标本制备及其保存
• 4.3 预处理和洗脱强度
• 4.4 原位PCR技术中的非特异性问题
• 4.5 原位PCR定位时信号数量问题
• 4.6 分析了热研7-33-97和橡胶RRIM600的核型
• 5 结论
• 参考文献
• 附录 试剂的配制
• 缩略语
• 致谢