论文摘要
第一部分：Enalapril对H202诱导的人脐血间充质干细胞凋亡的作用及机制研究研究目的急性心肌梗死发生后,梗死心肌局部恶劣的微环境,如缺血缺氧、炎症反应、氧化应激等,不利于移植后干细胞的生存,导致绝大部分移植后的干细胞凋亡或坏死。脐血间充质干细胞移植是目前干细胞移植治疗急性心肌梗死领域的新探索。如何减少移植后脐血间充质干细胞的凋亡是保证其移植疗效的关键。本研究在体外以H202刺激模拟急性心梗后的氧化应激微环境,观察血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）类代表性药物依那普利对氧化应激条件下人脐血间充质干细胞的存活及凋亡的影响。方法在体外以H2O2刺激模拟氧化应激微环境下,人脐血间充质干细胞分为：A：正常对照组B：过氧化氢刺激组C：依那普利组D：依那普利+过氧化氢组,其中过氧化氢组予以100μmol/L H2O2刺激培养,依那普利组予以10μmol/L干预后培养,依那普利+过氧化氢组则予以100μmol/L H2O2刺激后,给予10μmol/L依那普利继续培养。以MTT法检测细胞存活情况、Transwell法检测细胞迁移情况。另设立过氧化氢+P13K抑制剂LY294002组（E）、依那普利+过氧化氢+P13K抑制剂LY294002组（F）,Annexin-V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况,采用Western-Blot方法检测凋亡相关蛋白pAKt、 pGSK-3βser9、caspase-3的表达。结果1、H202刺激培养24小时后,人脐血间充质干细胞存活率明显下降（P<0.05）,48小时后下降更明显（P<0.05）。依那普利处理细胞24小时后,细胞存活率上升,但无统计学差异（P>0.05）,48小时后,与正常对照组相比,细胞存活率上升（P<0.05）。H202刺激细胞后,依那普利干预培养24小时、48小时均可使细胞存活率上升（P<0.05）。2、H202刺激培养后,人脐血间充质干细胞迁移能力明显下降（P<0.05）。依那普利处理正常细胞后,可提高细胞的迁移能力（P<0.05）。H2O2刺激细胞后,依那普利干预可改善人脐血间充质干细胞的迁移能力（P<0.05）3、H202刺激培养后,人脐血间充质干细胞凋亡明显增加（P<0.05）,可明显下调磷酸化AKt、磷酸化GSK-3pser9的表达,上调caspase-3的表达（P<0.05）。PI3K抑制剂LY294002可增强H2O2的促凋亡能力（P<0.05）。依那普利干预H2O2刺激后,可减少干细胞的凋亡（P<0.05）,上调磷酸化AKt、磷酸化GSK-3βser9的表达,下调caspase-3的表达（P<0.05）。这种能力可被PI3K抑制剂LY294002所抑制（P<0.05）。结论1、H2O2能明显抑制人脐血间充质干细胞存活,促进细胞凋亡：2、H2O2促进人脐血间充质干细胞凋亡,其机制可能与下调活化的AKt,增加GSK-3β活性,上调Caspase3的表达有关；3、H2O2诱导条件下,依那普利能促进人脐血间充质干细胞的存活,抑制其凋亡；4、H2O2诱导条件下,依那普利促进人脐血间充质干细胞存活,抑制其凋亡,其机制可能与活化AKt,降低GSK-3β活性,上调Caspase3的表达有关。第二部分：Enalapril对心梗微环境的干预作用对hUCMSCs的存活及心肌细胞凋亡的影响研究目的急性心肌梗死后的心肌细胞凋亡是发生心室重构的重要因素,依那普利已证实有抗心室重构作用。而静脉移植脐血间充质干细胞治疗急性心肌梗死疗效已被证实,但疗效有限,原因之一是移植后干细胞的存活数量不足。梗死心肌局部恶劣的微环境不利于移植后干细胞的生存,导致绝大部分移植后的干细胞凋亡或坏死。本部分实验旨在通过采用ACEI类代表药物依那普利干预急性心梗后的微环境,观察对移植后人脐血间充质干细胞存活的影响,进而研究两者联合治疗对心肌细胞凋亡及心室重构的影响。方法建造家兔急性心肌梗死模型后,随机分为：A：空白对照组B：心肌梗死对照组C：人脐血间充质干细胞移植组D：依那普利治疗组E：依那普利+人脐血间充质干细胞移植组。心梗术后A、B、C组立即予以生理盐水2ml/kg灌胃,D、E组以依那普利2mg/kg灌胃,同时C、E组于术后第7天经耳缘静脉注射含GFP标记的人脐血间充质干细胞3×106/500μL的生理盐水至术后2周,而A、B、D组同时间予以相同剂量的生理盐水静脉给药。细胞移植完成后1周,荧光检测各组脐血间充质干细胞归巢情况、TUNNEL法检测心肌细胞凋亡情况、HE染色及Massons染色检测各组心梗后心室重构情况。结果1、依那普利干预后,梗死心肌中表达绿色荧光的人脐血间充质干细胞明显增加（P<0.05）。2、心梗术后,心肌细胞凋亡数量及凋亡指数明显增加（P<0.05）。脐血间充质干细胞移植可减少凋亡的心肌细胞数量及凋亡指数（P<0.05）。依那普利治疗可减少凋亡的心肌细胞数量及凋亡指数（P<0.05）。依那普利联合人脐血间充质干细胞移植,比单纯的人脐血间充质干细胞移植更能够减少凋亡的心肌细胞数量及凋亡指数（P<0.05）。3、心梗后,心肌组织减少,排列紊乱,被大量的胶原纤维所代替。人脐血间充质干细胞移植、依那普利均可增加残存的心肌组织,减少胶原纤维的形成。依那普利联合人脐血间充质干细胞移植后,与单纯的人脐血间充质干细胞移植、单纯依那普利治疗相比,残存心肌明显增加,排列有序,胶原纤维减少。结论1、依那普利可增加移植后人脐血间充质干细胞在梗死心肌的存活数量；2、与单纯人脐血间充质干细胞移植相比,依那普利干预后的联合治疗可进一步抑制心肌细胞的凋亡；3、依那普利联合人脐血间充质干细胞移植,可拮抗急性心肌梗死后的心肌重构；4、依那普利联合人脐血间充质干细胞移植,拮抗急性心肌梗死后的心肌重构的机制可能是依那普利的干预作用增加了梗死心肌中存活的干细胞数量,进一步抑制了梗死后心肌细胞的凋亡。第三部分：Enalapril对心梗微环境的干预提高hUCMSCs静脉移植疗效及机制研究研究目的心肌梗死后伴随着一定程度的免疫炎症、氧化应激反应,而两者在心室重构的发生发展过程中起着至关重要的推动作用。梗死心肌局部恶劣的微环境是造成静脉移植后脐血间充质干细胞不能存活的重要原因。ACEI类药物是治疗急性心肌梗死的一线用药,被证实具有抗心室重构的作用。本研究假设ACEI类代表药物之一依那普利可增强脐血间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死的疗效,研究此协同作用是否与减少心梗后TNF-α的表达,抑制炎症反应,减少心梗后MDA含量、增强SOD活性,拮抗心梗后局部微环境的氧化应激反应有关。同时研究使用依那普利干预后,体内血管紧张素转换酶活性的变化,探讨联合治疗的有效性是否与依那普利抑制血管紧张素转换酶活性有关。方法建造家兔急性心肌梗死模型后,随机分为：A：空白对照组B：心肌梗死对照组C：人脐血间充质干细胞移植组D：依那普利治疗组E：依那普利+人脐血间充质干细胞移植组。心梗术后A、B、C组立即予以生理盐水2ml/kg灌胃,D、E组以依那普利2mg/kg灌胃,同时C、E组于术后第7天经耳缘静脉注射含人脐血间充质干细胞3×106/500μL的生理盐水至术后2周,而A、B、D组同时间予以相同剂量的生理盐水静脉给药。分别于术后、细胞移植后1周、细胞移植后2周,超声心动图检测各组家兔的心功能情况。细胞移植后2周,免疫组化及RT-PCR法检测心肌中TNF-α的表达,分别检测各组MDA含量、SOD活性及ACE活性情况。结果1、人脐血间充质干细胞移植后,可改善心梗后心功能指标LVEF和LVFS （P<0.05）。依那普利干预后,人脐血间充质干细胞移植能够更明显的改善心梗后心功能指标LVEF和LVFS（P<0.05）。2、心梗术后,心肌组织TNF-a表达明显增加（P<0.05）。人脐血间充质干细胞移植可减少心肌组织中TNF-a表达（P<0.05）。依那普利治疗可减少心肌组织中TNF-a表达（P<0.05）。依那普利联合人脐血间充质干细胞移植,比单纯的人脐血间充质干细胞移植更能够减少心肌组织中TNF-a表达（P<0.05）。3、心梗术后,MDA含量明显增加,SOD活性明显下降（P<0.05）。人脐血间充质干细胞移植可降低心梗后MDA含量、增强SOD活性（P<0.05）。依那普利治疗可降低心梗后MDA含量、增强SOD活性（P<0.05）。依那普利联合人脐血间充质干细胞移植比单纯的人脐血间充质干细胞移植更能够减少心梗后MDA含量、增强SOD活性（P<0.05）。4、心梗术后,ACE活性明显增加（P<0.05）。人脐血间充质干细胞移植可降低心梗后ACE活性（P<0.05）。依那普利治疗可明显降低心梗后ACE活性（P<0.05）。依那普利联合人脐血间充质干细胞移植,比单纯的人脐血间充质干细胞移植和单纯依那普利治疗更能够减少心梗后的ACE活性（P<0.05）。结论1、依那普利对心梗后局部微环境的氧化应激及炎症反应的干预作用,能提高人脐血间充质干细胞静脉移植改善心功能指标LVEF和LVFS的能力；2、依那普利对心梗后局部微环境的氧化应激及炎症反应的干预作用,可增强人脐血间充质干细胞移植后抑制炎症因子TNF-α的分泌及表达的能力；3、依那普利对心梗后局部微环境的氧化应激及炎症反应的干预作用,可增强人脐血间充质干细胞移植减少MDA含量、增强SOD活性的能力；4、依那普利对心梗后局部微环境中氧化应激及炎症反应的干预作用,可能与抑制ACE活性有关。