马铃薯GBSSⅠ基因的ihpRNAi载体转化试管薯片及转基因块茎相关生理指标分析

论文摘要

淀粉是一种可再生、可生物降解的天然高分子物质,不仅在食品工业中起着决定性的作用,而且在材料、医药及生物等领域的应用也日益引人注目。马铃薯（Solanum tuberosum L.）淀粉由于水分含量高、蛋白残留量低、糊化温度低,吸水力强,膨胀性好等特性已成为食品和工业的重要原料。支链和直链淀粉是淀粉的两个重要组分,由于二者的分子结构、分子聚集状态各异,使得它们有各自的应用领域,如直链淀粉具有近似纤维的性能,利用它制成的薄膜具有良好的透明度、柔韧性、抗张强度和水不溶性,并且无毒、无污染,可广泛应用于密封材料、包装材料和耐水压材料以及起皱和胶黏剂工业。支链淀粉具有抗老化性、改善冻融稳定性、高膨胀性、吸水性及增稠作用等功能,被广泛应用于食品加工、包装材料的制造、医药和建筑工业等领域。因此,培育出含有高支链淀粉或高直链淀粉的马铃薯品种具有重要的意义。颗粒结合型淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase,GBSS）是与淀粉粒结合的,与直链淀粉合成直接相关的酶。本研究利用根癌农杆菌介导法将GBSSⅠ基因的ihpRNAi载体转入马铃薯试管薯片中,利用PCR和PCR-Southern检测方法确定转基因植株,之后进行块茎淀粉结构以及相关生理指标的测定,分析GBSSⅠ基因的ihpRNAi载体对马铃薯淀粉结构的影响,以期获得支链淀粉含量高的马铃薯品系。已取得的研究结果如下:1.选用马铃薯四倍体栽培品种“甘农薯2号”试管薯作为供试材料,MS+1.00mg/L IAA+0.20mg/L GA3+2.00mg/L ZT+0.50mg/L 6-BA培养基作为试管薯薄片分化培养基,在含kan的培养基上获得36.5%的抗性芽分化率,61%的抗性芽生根率。对Kan抗性鉴定为阳性的转化植株进行nptII基因（新霉素磷酸转移酶II,676bp）和目的基因—GBSSⅠ基因ihpRNAi载体（正义片段（gbssA）-内含子,546 bp）的PCR检测,扩增到预期长度的特异性片段。68株转化植株中有61株扩增到特异性条带,占抗性筛选植株的90%。进一步对转化植株进行PCR-Southern检测,结果表明PCR扩增产物是nptⅡ基因和目的基因,说明外源基因已整合到马铃薯基因组中。2.用正置万能显微镜（Olmpus BX61,10×40）进行淀粉颗粒颜色观察,发现转基因马铃薯块茎中淀粉颗粒为红色或红蓝相间（蓝色较少）,而未转基因马铃薯块茎淀粉颗粒显色为红蓝相见色（蓝色较多）,说明GBSSⅠ基因的ihpRNAi片段可能抑制了GBSSⅠ基因的表达,转基因块茎中直链淀粉含量降低,支链淀粉含量显著升高。用双波长法测定马铃薯块茎直链和支链淀粉含量,结果表明转基因马铃薯块茎中的支链淀粉含量显著高于直链淀粉含量。参照（Nakamura、George,1989）测定GBSS酶和SSS酶的方法,得到转基因马铃薯块茎中控制直链淀粉的GBSS酶的活性显著低于未转基因植株;而其控制支链淀粉的SSS酶的活性显著高于未转基因植株。3.转基因马铃薯块茎中还原糖、可溶性糖、可溶性蛋白、干物质等的含量和出粉率与未转基因马铃薯块茎间并无显著差异,说明在马铃薯中导入的GBSSⅠ基因ihpRNAi载体对马铃薯块茎的这些生理特性并无影响。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一章 文献综述
• 1.1 马铃薯淀粉在各行业中的应用
• 1.1.1 在食品行业中的应用
• 1.1.2 在非食品行业中的应用
• 1.2 马铃薯淀粉的特点和基本性质
• 1.2.1 直链淀粉的特点和应用
• 1.2.2 支链淀粉的特点和应用
• 1.3 淀粉合成机制以及与之相关的酶
• 1.3.1 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）
• 1.3.2 淀粉合成酶（SS）
• 1.3.3 淀粉分支酶（SBE）
• 1.3.4 淀粉去分支酶（DBE）
• 1.4 各种抑制基因表达方法的研究进展
• 1.4.1 RNA 干扰
• 1.4.2 反义基因技术研究
• 1.5 马铃薯转基因受体材料的研究
• 1.6 本研究的目的和意义
• 1.7 技术路线
• 第二章 马铃薯 GBSSⅠ基因 ihpRNAi 载体转化试管薯片 及其转基因植株的获得
• 2.1 试验材料及方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 转基因马铃薯植株的再生
• 2.2.2 转化植株在培养基中的生长情况
• 2.2.3 转基因马铃薯植株的PCR 鉴定
• 2.2.4 转基因马铃薯植株的PCR-Southern 鉴定
• 2.2.5 温室中转化植株的结薯情况
• 2.3 讨论
• 第三章 转GBSSⅠ基因的ihpRNAi 载体马铃薯块茎淀粉结构及相关生理指标分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 转基因马铃薯块茎淀粉粒显色变化
• 3.2.2 颗粒结合型淀粉合成酶（GBSS）和可溶性淀粉合成酶（SSS）活性的在转基因马铃薯块茎中的表达量
• 3.2.3 转基因马铃薯块茎中支链、直链淀粉含量
• 3.2.4 其它生理指标测定
• 3.3 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介