茅苍术内生真菌与其宿主植株互作机理的研究

论文摘要

茅苍术Atractylodes lancea （Thunb.） DC为菊科术属多年生草本植物。其干燥根茎为中药苍术,是江苏省著名的地道药材。苍术主要活性成分是挥发油,主要功效为燥湿健脾、祛风散寒和明目。近年来由于野生茅苍术资源被严重破坏,并且茅苍术的人工栽培具有一定难度,因此如何解决日益增长的市场需求成为了一个难题。为了提高人工种植药材品质,更好的开发利用内生菌资源,本文尝试从微生物和植物生物技术等角度,开展对茅苍术内生真菌与其宿主植株互作机理的研究。首先,为了研究宿主植物次级代谢产物对内生真菌生长抑制作用,以药用植物茅苍术及其内生真菌为材料,采用有机溶剂萃取法提取茅苍术挥发油,应用滤纸片扩散法和平板涂布法研究茅苍术挥发油对其内生真菌及其它外源真菌的抑菌作用。结果表明：挥发油对3种内生真菌生长具有抑制作用；对酵母、水霉有很强的抑菌活性；对根霉、犁头霉抑菌作用不明显；对绿色木霉、黑曲霉的产孢具有抑制作用；对疫霉生长无抑制作用。在高浓度挥发油胁迫下,内生真菌菌丝分支增多,分支间距离变短,气生菌丝生长受到抑制。两种内生真菌对挥发油具有代谢转化能力,降低了其主要成分的含量。表明茅苍术挥发油对内生真菌生长具有限制调控作用,但内生真菌能够通过自身分解代谢适应茅苍术挥发油。其次,通过建立内生真菌孔球孢霉Gilmaniella sp. （AL12）及其真菌诱导子与茅苍术无菌苗的共生体系,来进一步研究内生真菌及其诱导子对宿主植株防御代谢反应的影响。结果表明已分离的内生真菌AL12能够重新侵染并长期定殖于宿主体内,与宿主植株建立良好的共生关系。显微观察表明,真菌菌丝在宿主叶片细胞间隙间表现出连续及弯曲的生长模式。真菌接种组中,抗性相关酶系PAL、PPO酶活力在试验初期增长缓慢,随后稳步上升,后期达到峰值,而POD酶活力在试验初期达到峰值。防御水解酶系几丁质酶及β-1,3-葡聚糖酶的酶活力始终高于对照组水平。诱导子处理组中,所有相关酶活力均在试验初期达到峰值,随后缓慢下降。此外,与诱导子处理组相比,内生真菌的定殖能够提高宿主植株光合速率,增加叶片中叶绿素及可溶性糖含量。试验结果表明,长期施用真菌诱导子能够显著提高宿主体内次级代谢产物挥发油的含量,然而挥发油中主要活性成分并未显示出规律性的增减。与此同时,随着试验天数的增加,内生真菌的定殖能够逐渐降低宿主代谢产物挥发油中β-桉叶油醇的含量,同时规律性增加苍术酮及苍术素的含量。相比于诱导子,内生真菌的接种更有利于宿主植株积累特征性次级代谢产物,影响其主要活性成分的含量及配比,从而提高宿主药用品质。NO, SA与H202是三种重要的信号分子,在植物防御反应中起到关键性作用。为了进一步研究NO, SA和H202在挥发油积累中起到的作用,我们通过外源添加NO特异性淬灭剂cPTIO, SA合成抑制剂trans-CA, H2O2合成抑制剂膜NADPH氧化酶抑制剂DPI及过氧化氢酶CAT的方式研究了三种信号分子在植株体内潜在的信号传导途径。结果表明分别或联合运用高浓度的cPTIO, trans-CA,及DPI/CAT不仅能够抑制真菌诱导的相关信号分子的迸发,而且能够明显降低挥发油中主要活性成分的积累。另一方面,外源添加NO供体SNP同样能够诱导植株体内SA和H2O2的产生以及挥发油的积累。然而,联合添加trans-CA及DPI/CAT能够有效抑制外源NO所产生的诱发效应。外源SA和H202对植株体内NO的迸发没有促进作用,然而它们能够逆转cPTIO, trans-CA,及DPI/CAT对于挥发油积累总的抑制作用。此外,外源H202能够促进SA的合成,但DPI/CAT无法抑制真菌诱导的宿主体内SA的合成及其在挥发油积累中所产生的作用。试验结果表明NO通过依赖于SA和H202的信号途径介导内生真菌诱发宿主体内挥发油的积累。植物内源性H202能影响SA的合成,但并不直接作为其上游信号分子。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 茅苍术简介
• 1.1.1 生物学特性及资源分布
• 1.1.2 苍术药材活性成分及药用价值
• 1.1.2.1 挥发油主要成分分析
• 1.1.2.2 苍术药材的主要功效
• 1.2 植物内生真菌研究进展
• 1.2.1 进化和分布
• 1.2.2 内生真菌与植物相互作用
• 1.2.3 内生真菌与宿主植株建立拮抗平衡共生关系的研究
• 1.3 内生真菌影响宿主植株合成积累次级代谢产物的研究
• 1.3.1 内生真菌对宿主植株生态适应性的影响
• 1.3.2 多种信号分子介导内生菌侵染诱发宿主积累活性代谢产物
• 1.3.2.1 NO
• 1.3.2.2 SA
• 1.3.2.3 H202
• 1.3.3 开发与利用内生真菌对人工种植中药材品质的影响
• 第2章 茅苍术挥发油对三种内生真菌及七种外源真菌的抑菌活性
• 2.1 材料与试剂
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 挥发油的提取
• 2.2.2 菌种活化及菌悬液的制备
• 2.2.3 含菌平板的制备
• 2.2.4 挥发油抑菌活性测定
• 2.2.5 最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）的测定
• 2.2.6 挥发油对内生真菌菌丝形态的影响试验
• 2.2.7 内生真菌对挥发油的分解代谢及挥发油主要成分含量的测定
• 2.2.8 气相色谱条件
• 2.2.9 统计分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 茅苍术挥发油对各供试菌的抑菌效果
• 2.3.2 茅苍术挥发油对各供试菌种的最低抑菌浓度（MIC）
• 2.3.3 茅苍术挥发油对3种内生真菌菌丝形态的影响
• 2.3.4 内生真菌对茅苍术挥发油主要成分的影响
• 2.4 讨论
• 第3章 内生真菌AL12及其诱导子对茅苍术组培苗防御代谢反应的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 无菌苗的建立及分化培养
• 3.1.2 内生真菌的培养及诱导子的制备
• 3.1.3 内生真菌AL12接种及外源诱导子施加
• 3.1.4 内生真菌AL12侵染宿主植株的验证
• 3.1.5 酶活性测定
• 3.1.5.1 PAL酶活性测定
• 3.1.5.2 POD酶活性测定
• 3.1.5.3 PPO酶活性测定
• 3.1.5.4 几丁质酶活性测定
• 3.1.5.5 β-1,3葡聚糖酶活性测定
• 3.1.6 可溶性蛋白含量测定
• 3.1.7 茅苍术组培苗光合特性的测定
• 3.1.8 茅苍术植株挥发油提取及GC分析
• 3.1.9 统计分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 接种内生真菌及施加外源诱导子对茅苍术组培苗生长态势的影响
• 3.2.2 内生真菌AL12侵染宿主后的定殖生长模式及重分离试验
• 3.2.3 接种内生真菌及施加外源诱导子对茅苍术组培苗防御相关酶系PAL、PPO及POD酶活性的影响
• 3.2.4 茅苍术组培苗中防御水解酶系的变化情况
• 3.2.5 接种内生真菌及施加外源诱导子对茅苍术组培苗光合特性的影响
• 3.2.6 接种内生真菌及施加外源诱导子对茅苍术组培苗积累挥发油的影响
• 3.3 讨论
• 3.3.1 接种内生真菌及外源诱导子处理对苍术组培苗生长态势的影响
• 3.3.2 真菌侵染及外源诱导子处理对苍术组培苗防御反应的影响
• 3.3.3 接种内生真菌及外源诱导子处理对宿主植株积累次级代谢产物的影响
• 2O₂介导内生真菌促进茅苍术组培苗中挥发油的积累'>第4章 NO、SA和H₂O₂介导内生真菌促进茅苍术组培苗中挥发油的积累
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 植物材料及其分化培养
• 4.1.2 内生真菌培养及其植体外接种
• 2O₂含量的测定'>4.1.3 植株组织内源性NO和H₂O₂含量的测定
• 4.1.4 植株组织内源性SA的提取及HPLC测定
• 4.1.4.1 SA的提取
• 4.1.4.2 SA含量的测定
• 2O₂及其合成抑制剂的添加'>4.1.5 外源信号分子NO,SA,H₂O₂及其合成抑制剂的添加
• 4.1.6 苍术组培苗挥发油的提取及气相色谱（GC）分析
• 4.1.7 统计分析
• 4.2 结果
• 2O₂迸发'>4.2.1 内生真菌侵染诱发植体内源性NO、SA及H₂O₂迸发
• 4.2.2 内生真菌侵染激发三种潜在的信号传导途径
• 2O₂和SA介导内生真菌诱发茅苍术组培苗挥发油积累'>4.2.3 NO、H₂O₂和SA介导内生真菌诱发茅苍术组培苗挥发油积累
• 4.3 讨论
• 全文小结与展望
• 参考文献
• 附录A:硕士在读期间发表的学术论文
• 附录B:硕士在读期间所获荣誉
• 致谢