外源20-羟基蜕皮激素对洋虫的影响及其EcR和HR3基因的表达分析

论文摘要

洋虫（Palembus dermestoides（Fairmaire））隶属于鞘翅目（Coleotera）,拟步甲科（Tenebrionidae）,菌甲亚科（Diaperinae）,菌甲族（Diaperini）,原为国内外广泛分布的仓库害虫,但由于其具有很高的药用价值和饲用价值而成为一种重要的资源昆虫。本文以洋虫（Palembus dermestoides）为研究对象,采用RT-PCR技术,对其蜕皮激素受体（EcR）基因序列片段进行克隆,并进行系统发育分析及生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR技术,对不同发育时期洋虫进行EcR和激素受体接受子3（HR3）基因mRNA水平表达分析;不同浓度的外源20-羟基蜕皮激素（20E）注射处理不同发育时期的洋虫,对处理后虫体外部形态变化、死亡率、羽化率等进行了研究;采用透射电镜技术,研究了外源20E处理后对洋虫蛹体壁表皮层、皮细胞层及底膜超微结构的影响;利用透射电镜技术,研究了外源20E处理后对中肠超微结构的影响,得出以下主要结论:1、洋虫蜕皮激素受体（PdEcR,JQ666843）基因片段长738bp,与EcR-A亚型具有较高同源性,编码244个氨基酸,其中最长ORF为700bp（从第39bp-第737bp）,编码233个氨基酸;预测PdEcR的分子质量为25686.5Da,分子式为C1099H1738N3140370S13;其理论等电点PI为7.67,为碱性蛋白;PdEcR蛋白中不存在信号肽,为非分泌型蛋白;从整体上看,PdEcR表现出亲水性,但在功能区存在多个疏水区域;PdEcR蛋白不含跨膜区域;PdEcR蛋白含有位于DNA结合域的核受体家族所特有的保守功能结构;属于同目昆虫的EcR基因进化关系较近,同一物种EcR基因不同亚型间的差异比与其他物种的EcR基因间差异较小。2、EcR基因在洋虫不同发育时期的雌、雄个体中均有表达:EcR基因在2ndd雌蛹中表达量最高,在3rdd-6thd雌蛹中表达量逐渐降低,且6thd雌蛹中EcR基因的表达量已低于末龄幼虫时的水平,1std雌成虫中表达量稍有回升,在3rdd雌成虫中表达下降后,6thd雌成虫中表达量又小幅度回升,成虫期样本的表达量均低于末龄幼虫时的水平。针对洋虫雄性个体,1std-2ndd雄蛹体内EcR表达量非常高,并且表达量1std>2ndd雄蛹,在3rdd雄蛹中的表达量急剧下降,至4thd雄蛹表达稍有回升,略高于末龄幼虫时的水平,但在5thd雄蛹中表达量又降低,6thd雄蛹至成虫期EcR的表达量波动平缓,且均低于末龄幼虫时的水平。综合本研究中EcR基因在洋虫雌雄个体内的相对表达量分析结果,我们可以看出,在成虫期和蛹期,EcR基因在雌性洋虫体内仅有一个表达高峰,出现在2ndd雌蛹,而在雄性洋虫体内有两个表达峰,横跨1std-2ndd雄蛹。3、HR3基因在洋虫不同发育时期的雌、雄个体中也均有表达:雌性洋虫HR3基因有三个相对表达峰,分别出现在预蛹期、4thd雌蛹和6thd雌蛹中,其中4thd雌蛹中的相对表达量最高,约为预蛹期表达峰的3倍,6thd雌蛹的2倍,末龄幼虫期的30倍;成虫期HR3基因的相对表达量呈递减趋势,1std雌成虫中HR3的表达量约高于末龄幼虫中的4倍,但至6thd雌成虫时,HR3的表达量已低于末龄幼虫期的表达水平。针对雄性洋虫,HR3基因有两个相对表达峰,分别出现在预蛹期和4thd雄蛹中,其中4thd雄蛹中HR3基因的表达峰极高,比雌虫的最高表达峰还约高出5倍;成虫期HR3基因的相对表达量呈小幅度递增趋势,均高于末龄幼虫期的相对表达水平。从雌、雄洋虫体内HR3基因的相对表达趋势看,雌、雄虫的最高相对表达量均出现在蛹期第4d,且雄虫的表达峰高于雌虫的表达峰。4、本研究所使用的各浓度的20-羟基蜕皮激素溶液对洋虫末龄幼虫的毒杀作用均不大,即使使用最大浓度（10μg/μL）的20E对幼虫进行处理,在处理后96thh,其累积校正死亡率也仅达到30%左右;在处理后6thh-96thh时间内,所使用20-羟基蜕皮激素浓度越大,就越早引起洋虫末龄幼虫死亡;10μg/μL处理组处理后12thh-36thh,发现被同类嗜食而亡的虫体,占该组整体死亡率的50%,而在对照组及另外两个处理组中均未发现幼虫间的嗜食同类行为,因此,一定浓度的20-羟基蜕皮激素可以增强昆虫幼虫间嗜食同类行为;10μg/μL处理组能够使洋虫末龄幼虫提前启动蜕皮行为,但能未完成蜕皮,导致蜕皮受阻而致死。1μg/μL和5μg/μL的20-羟基蜕皮激素溶液对洋虫蛹的死亡率影响很小,而10μg/μL的20E溶液在处理后96thh,蛹的累积校正死亡率达60%左右,毒杀作用是5μg/μL组的6倍,死亡个体呈铜褐色、僵硬、干瘪状态;1μg/μL和5μg/μL处理组均能够引起蛹提前羽化,而1Oμg/μL处理组未发现有羽化为成虫的个体。在用不同浓度20-羟基蜕皮激素对雌、雄洋虫成虫进行处理后96thh内发现,除1μg/μL处理组外,5μg/μL和1Oμg/μL的20E处理对雄成虫造成死亡的时间早于雌虫,且同一时间雄虫的累积校正死亡率大于等于雌虫,说明洋虫雄成虫对5μg/μL和10μg/μL浓度的20E处理较雌虫敏感。5、用10μg/μL的20-羟基蜕皮激素处理洋虫蛹,观察了处理后6thh-96thh期间洋虫蛹体壁超微结构的变化情况。结果显示:处理组在处理后6thh,与对照组蛹体壁区别不明显,表皮层合成层数少,与皮细胞层连接紧密;皮细胞层细胞质区域内含物丰富,细胞分泌活动旺盛,不断向外分泌合成表皮层,微绒毛顶端可见新形成的内表皮片层结构;底膜结构完整致密,与皮细胞层连接紧密。20E处理后12thh时,体壁的皮细胞层与表皮层分离,出现蜕皮间隙,微绒毛出现肿胀,形成蘑菇状突起,底膜结构仍清晰可见,与皮细胞层紧密连接。20E处理后24thh时,皮细胞层与表皮层间的蜕皮间隙增大;皮细胞顶膜微绒毛受破坏严重,皮细胞之间出现细胞间隙,胞质内细胞器含量丰富,线粒体电子密度高;底膜结构完好,与皮细胞层紧密相连。20E处理后36thh时,皮细胞顶膜结构受到破坏,蜕皮间隙内的蜕皮液和消化原来的内表皮产生的物质扩散,胞质内细胞器含量较丰富,线粒体电子密度增高,电子疏松泡数量增多,皮细胞的核膜与细胞质间出现间隙,底膜结构变薄,此时尚未开始分泌合成新的表皮层。20E处理后48thh,新表皮层初步形成,旧表皮层与新表皮层间出现了空腔,将要老落的组织中含有一些可能与蜕皮有关的颗粒,孔道由皮细胞层延伸至新表皮层,营养物质或合成原料经孔道由皮细胞层向表皮层输送,核膜与胞质间隙扩大,线粒体电子密度升高,电子疏松泡数目增多,靠近底膜处的皮细胞层出现大面积空白区域,底膜结构变薄。处理后72ndh,观察不到底膜结构,皮细胞层与新表皮层松散连接或分离,皮细胞层内出现大面积空白区域,老落松散组织并未与新表皮分离。20E处理后96thh,处理组体壁皮细胞胞质内空白区域增加,电子疏松泡数量增加,细胞内能观察到细胞核,已很难辨认出细胞器结构;观察不到底膜结构,细胞状态进一步恶化,濒临降解。6、10μg/μL的20-羟基蜕皮激素处理洋虫末龄幼虫后,观察处理后96thh内试虫中肠超微结构的变化情况。处理组洋虫在中毒初期其中肠上皮细胞微绒毛受破坏严重,细胞核内染色质仍分布均匀,细胞间连接紧密,细胞胞质浓密,胞质内细胞器含量丰富;随着试虫中毒症状的逐渐加重,试虫中肠超微结构的变化也就越明显,在试虫中毒中期,其相邻的肠壁细胞间出现细胞间隙,细胞核皱缩,核仁不规则变大,染色质凝聚成块,细胞核附近的细胞质内出现空白区域,核膜与细胞质间也出现间隙,线粒体电子密度升高;在试虫中毒接近死亡但尚未死亡时,其中肠肠壁细胞间距离进一步扩大,细胞膜受到破坏,出现裸露的细胞核,细胞质区域膜类细胞器受破坏严重,线粒体肿胀变性严重,嵴减少断裂,细胞逐渐解体,观察不到完整的细胞结构,剩下裸露的细胞核。因此,20E对试虫中肠微绒毛、细胞膜、膜类细胞器（内质网）等膜系统的破坏作用,是20E的致毒机理之一。本项研究首次从鞘翅目昆虫洋虫中克隆获得EcR基因的序列片段,通过实时荧光定量PCR技术对洋虫不同发育时期个体内EcR和HR3基因进行mRNA水平表达分析,并利用植物源20-羟基蜕皮激素对各时期洋虫进行处理,对其处理前后的宏观及微观变化进行了比较分析,得到了如上所述结果。这些结果将为今后进一步研究蜕皮激素及核受体在昆虫体内的具体功能,以及植物源蜕皮激素类杀虫剂的开发利用提供资料参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 洋虫的概述
• 1.1.1 洋虫的分类地位及命名
• 1.1.2 洋虫的形态特征
• 1.1.3 洋虫的生活习性及生活史
• 1.1.4 洋虫的饲养
• 1.1.5 洋虫的营养成分
• 1.1.6 洋虫的保健作用
• 1.2 昆虫蜕皮行为的激素调控机理
• 1.2.1 昆虫蜕皮激素及其功能
• 1.2.2 蜕皮激素合成的信号途径
• 1.2.3 核受体基因家族与蜕皮激素信号传导
• 1.2.4 核受体基因结构
• 1.2.5 蜕皮激素受体（EcR）的研究进展
• 1.2.6 激素受体接受子3（HR3）的研究进展
• 1.3 本研究的目的与意义
• 1.4 本研究的内容与技术路线
• 1.4.1 研究内容
• 1.4.2 技术路线
• 2 洋虫蜕皮激素受体（EcR）基因的克隆及序列分析
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 总RNA质量检测及浓度测定
• 2.3.2 洋虫EcR基因的克隆及鉴定
• 2.3.3 洋虫EcR基因序列测定与同源性比对
• 2.3.4 洋虫EcR基因的系统进化分析
• 2.3.5 洋虫PdEcR序列的开放阅读框分析
• 2.3.6 洋虫PdEcR氨基酸组成、分子量、等电点分析
• 2.3.7 洋虫PdEcR蛋白信号肽分析
• 2.3.8 洋虫PdEcR蛋白疏水性分析
• 2.3.9 洋虫PdEcR蛋白跨膜结构分析
• 2.3.10 洋虫PdEcR蛋白保守区域分析
• 2.3.11 洋虫PdEcR蛋白质三级结构预测
• 2.4 讨论
• 2.4.1 总RNA提取的重要性
• 2.4.2 洋虫EcR基因克隆的意义
• 2.5 本章小结
• 3 洋虫不同发育时期EcR和HR3基因mRNA水平的表达
• 3.1 前言
• 3.1.1 实时荧光定量PCR的特点
• 3.1.2 实时荧光定量PCR的基因定量方法
• 3.1.3 利用实时荧光定量PCR研究基因表达的意义
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 总RNA质量检测及浓度测定
• 3.3.2 引物有效专一性检测
• 3.3.3 qRT-PCR的优化条件
• 3.3.4 qRT-PCR技术检测洋虫不同发育时期EcR基因的mRNA水平表达
• 3.3.5 qRT-PCR技术检测洋虫不同发育时期HR3基因的mRNA水平表达
• 3.4 讨论
• 3.4.1 实验整体操作细节的重要性
• 3.4.2 内参基因选择的重要性
• 3.4.3 引物设计及PCR反应体系优化的重要性
• 3.4.4 洋虫不同发育时期EcR基因的mRNA水平表达分析
• 3.4.5 洋虫不同发育时期HR3基因的mRNA水平表达分析
• 3.5 本章小结
• 4 外源20-羟基蜕皮激素对洋虫幼虫、蛹及成虫发育的影响
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 供试昆虫
• 4.2.2 供试样品配制
• 4.2.3 生物测定方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 外源20-羟基蜕皮激素对洋虫幼虫发育的影响
• 4.3.2 外源20-羟基蜕皮激素对洋虫蛹发育的影响
• 4.3.3 外源20-羟基蜕皮激素对洋虫成虫发育的影响
• 4.4 讨论
• 4.4.1 外源20-羟基蜕皮激素对洋虫幼虫发育的影响
• 4.4.2 外源20-羟基蜕皮激素对洋虫蛹发育的影响
• 4.4.3 外源20-羟基蜕皮激素对洋虫成虫发育的影响
• 4.5 本章小结
• 5 外源20-羟基蜕皮激素对洋虫体壁超微结构的影响
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 供试昆虫和试剂
• 5.2.2 实验器材
• 5.2.3 实验药品
• 5.2.4 实验溶液配制
• 5.2.5 试虫处理方法
• 5.2.6 体壁透射电镜样品制备和观察
• 5.3 结果与分析
• thh洋虫蛹体壁超微结构的电镜观察'>5.3.1 外源20E处理后6^thh洋虫蛹体壁超微结构的电镜观察
• thh洋虫蛹体壁超微结构的电镜观察'>5.3.2 外源20E处理后12^thh洋虫蛹体壁超微结构的电镜观察
• thh洋虫蛹体壁超微结构的电镜观察'>5.3.3 外源20E处理后24^thh洋虫蛹体壁超微结构的电镜观察
• thh洋虫蛹体壁超微结构的电镜观察'>5.3.4 外源20E处理后36^thh洋虫蛹体壁超微结构的电镜观察
• thh洋虫蛹体壁超微结构的电镜观察'>5.3.5 外源20E处理后48^thh洋虫蛹体壁超微结构的电镜观察
• ndh洋虫蛹体壁超微结构的电镜观察'>5.3.6 外源20E处理后72^ndh洋虫蛹体壁超微结构的电镜观察
• thh洋虫蛹体壁超微结构的电镜观察'>5.3.7 外源20E处理后96^thh洋虫蛹体壁超微结构的电镜观察
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 6 外源20-羟基蜕皮激素对洋虫中肠超微结构的影响
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 供试昆虫和试剂
• 6.2.2 实验器材、实验药品及实验溶液配制
• 6.2.3 试虫处理方法
• 6.2.4 中肠透射电镜样品制备和观察
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 对照组洋虫幼虫中肠超微结构观察
• 6.3.2 外源20E处理后洋虫幼虫中肠超微结构变化
• 6.4 讨论
• 6.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢