秦岭森林土壤芽孢杆菌的分离筛选、鉴定及抑菌作用研究

论文摘要

秦岭作为我国重要的南北地理分界线更是黄河与长江流域的分水岭，其森林茂密、植被种类丰富、土壤中富含有机质、微生物资源特别是优势细菌丰富而独特，有着巨大的研究价值和潜力。芽孢杆菌具有内生芽孢、抗逆性强、繁殖速度快、营养要求简单和易于在植物根围定殖的特点，使其在植物病害生物防治中被广泛地研究和利用。本研究旨在从秦岭太白山区采集的森林土壤样品中分离出对多种植物病原真菌具有较强生防作用的芽孢杆菌，对其经行鉴定、发酵优化，对其抑菌机理经行研究，以期得到用于植物病害防治的微生物农药新资源。本试验采用传统微生物分离培养方法，从采集的23份土壤样品中分离到芽孢杆菌467株。采用皿内平板对峙法，以稻瘟病菌、番茄灰霉病菌、苹果腐烂病菌、梨黑星病菌、小麦赤霉病菌、玉米大斑病菌、苹果轮纹病菌等10种真菌为供试植物病原真菌，对所分离的541株细菌进行拮抗初筛，得到抗真菌活性较强的细菌9株。进一步对这9株菌进行发酵滤液复筛和单孢拮抗性筛选，最终确定了一株具有较强拮抗性的最优菌株An‐ctc‐y‐1，对稻瘟病菌和番茄灰霉病菌抑制效果最好，抑制率分别达到93.50％和92.60％。依据An‐ctc‐y‐1菌株的培养特征、形态学特征、生理生化特征及16S rRNA测定及分析比对，参考相关文献，初步确定An-ctc-y-1为芽孢杆菌属中的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus）。运用单因素试验和正交试验对An-ctc-y-1菌株进行了发酵优化，筛选到菌株基础培养基为LB培养基；摇瓶最佳培养条件为：初始最佳pH值7.5，最佳发酵时间48h，最佳温度32℃，摇瓶转速150r/min。菌株An-ctc-y-1的抑菌谱较广，对多种病原菌均有很高的拮抗活性，对稻瘟病菌、番茄灰霉病菌、梨黑星病菌、辣椒疫霉病菌及苹果轮纹病菌的抑制效果均达90%以上。代谢产物抑菌机理研究表明：被抑制的植物病原真菌菌丝生长缓慢，大部分扭曲，肿大，畸形，有的顶部出现膨大的泡囊，菌丝的分支增多，原生质浓缩，分布不均匀，有的原生质体出现破碎外露；An-ctc-y-1代谢产物不仅能够抑制病原菌孢子的萌发而且致使孢子畸形。通过对An‐ctc‐y‐1菌株代谢产物对温室病害的预防和治疗作用的测定，发现其对番茄灰霉病、番茄疫霉根腐病有很好的治疗作用；An‐ctc‐y‐1菌株发酵液能明显提高番茄、黄瓜等种子发芽率，有一定的促进生长的作用，具体作用机理还有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物病害生物防治中芽孢杆菌的应用
• 1.2 芽孢杆菌防治植物病害的作用机制
• 1.2.1 芽孢杆菌的抗生作用
• 1.2.2 芽孢杆菌的竞争机制
• 1.2.3 芽孢杆菌的溶菌机制
• 1.2.4 芽孢杆菌的诱导抗性产生和促生作用
• 1.3 有关芽孢杆菌的分类鉴定
• 1.4 芽孢杆菌防治植物病害的应用及存在问题
• 1.5 论文的设计思路
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 土样的采集
• 2.1.2 供试病原菌
• 2.1.3 试验所用培养基种类及配方
• 2.1.4 仪器设备
• 2.1.5 试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 土壤细菌的分离
• 2.2.2 拮抗芽孢杆菌的室内筛选试验
• 2.2.3 生防芽孢杆菌菌株的初步鉴定
• 2.2.4 拮抗芽孢杆菌菌株发酵条件的优化
• 2.2.5 目标细菌菌株An‐ctc‐y‐1活性产物的粗提取
• 2.2.6 目标细菌菌株抑菌防病机理初探
• 2.2.7 An‐ctc‐y‐1活性产物对温室病害的预防和治疗作用测定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 土壤拮抗芽孢杆菌的分离及筛选结果
• 3.1.1 土壤拮抗芽孢杆菌初筛结果
• 3.1.2 拮抗菌发酵液复筛结果
• 3.1.3 拮抗芽孢杆菌单胞筛选结果
• 3.2 生防芽孢杆菌优良菌株An‐ctc‐y‐1的初步鉴定
• 3.2.1 菌落形态特征
• 3.2.2 常规生理生化特征
• 3.2.3 16S rRNA基因序列测定及分析比对
• 3.3 拮抗菌发酵条件的优化
• 3.3.1 拮抗菌株An‐ctc‐y‐1基础培养基的筛选
• 3.3.2 发酵初始最佳pH值的选择
• 3.3.3 发酵最佳时间的选择
• 3.3.4 发酵最佳温度的选择
• 3.3.5 摇瓶转速的选择
• 3.4 生防菌株An‐ctc‐y‐1活性产物的作用机理初探
• 3.4.1 生防菌株An‐ctc‐y‐1的抑菌谱初探
• 3.4.2 菌株An‐ctc‐y‐1代谢产物对病原菌菌丝形态的影响
• 3.4.3 菌株An‐ctc‐y‐1发酵液对病原真菌菌丝生长的抑制作用
• 3.4.4 菌株An‐ctc‐y‐1代谢产物对病原菌孢子萌发的影响
• 3.5 An‐ctc‐y‐1活性产物对温室病害的预防和治疗作用测定
• 3.5.1 An‐ctc‐y‐1发酵液对由番茄疫霉病菌引起的番茄疫霉根腐病的防治作用
• 3.5.2 An‐ctc‐y‐1发酵液的促生作用
• 第四章 结论
• 第五章 讨论
• 5.1 秦岭微生物资源中芽孢杆菌的开发与利用
• 5.2 芽孢杆菌在生防微生物中的优势
• 5.3 单孢分离的应用
• 5.4 关于生防芽孢杆菌 An‐ctc‐y‐1 菌株的鉴定的讨论
• 5.5 关于An‐ctc‐y‐1菌株抑菌谱及抑菌机理的讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介