三种蛙皮肤中促胰岛素释放肽的生理活性研究

论文摘要

促胰岛素释放肽是一类能调节胰岛素分泌的生物活性多肽,研究其结构特征、生理活性、以及临床药物应用可为Ⅱ型糖尿病开辟新的治疗途径和治疗理念。同时,以多肽类毒素为分子探针,有利于进一步洞悉胰岛素分泌的信号调节机制和了解某些毒素的致病机理。目前,国际上关于胰高血糖素样肽-1（GLP-1）及其类似物的药理作用的基础研究和临床药物研发进展非常迅速,而且国外学者已经分别从昆虫类、两栖类、爬行类等多种动物体内发现了促胰岛素释放肽。但是,国内却很少有学者从事有关天然促胰岛素释放肽分离鉴定的研究工作。我国博大丰富的多物种生物资源库为我们的相关研究提供了天然优势,分离纯化促胰岛素释放肽并探究其作用机理可为开拓建立本领域研究平台和填补国内相关研究的空白奠定重要基础,因此该项研究工作具有重要而又深远的意义。本研究以无指盘臭蛙（Odorrana grahami）、棕点湍蛙（Amolops loloensis）和黑带蛙（Rana nigrovittata）三种分布于云南的两栖类动物为实验材料,主要通过葡聚糖凝胶（Sephadex G-50）分子筛过滤和反相高效液相层析（RP-HPLC）等研究手段,对蛙皮肤分泌液进行分离纯化,得到十多个有胰岛素释放活性的分离峰。运用飞行质谱仪分别测定分离峰的相对分子质量,并采用Edman降解法得到八个促胰岛素释放肽的氨基酸序列,分别命名为:odorranain-G（十三肽）、odorranain-Z（二十肽）、odorranain-L1（二十一肽）、odorranain-Y（十一肽）、odorranain-X1（十六肽）、odorranain-X2（十六肽）、amolopin（十六肽）和nigroain-A（十七肽）;利用活体蛙提取mRNA,根据已知保守的信号肽序列设计引物构建cDNA文库,将PCR扩增产物转化大肠杆菌并测序阳性克隆,发现由多肽基因克隆翻译得到的氨基酸序列与分离纯化得到的多肽N-末端测序结果一致。分别采用体外培养的大鼠胰岛和INS-1胰岛β细胞系两种模型检测促胰岛素释放活性,125I放射性免疫分析法检测胰岛素含量。利用钙离子荧光探针Fluo-3和激光共聚焦显微镜对细胞内钙离子浓度变化的研究证实:促胰岛素释放肽刺激β细胞分泌的分子机制不是由于增加钙离子内流引起的。由于糖尿病可以引起多种有严重危害性的并发症,对促胰岛素释放肽的其他活性的研究十分必要。本研究表明,促胰岛素释放肽odorranain-G还具有抗细菌、真菌活性,可见该多肽在降糖的同时还可以控制糖尿病引起的各种感染,有很好的应用前景。而odorranain-Z还具有血管生成抑制活性,是当前研究治疗糖尿病视网膜病热点问题,因此odorranain-Z也具有很好的药物开发潜力。本研究在国内首次建立了促胰岛素释放肽分离纯化、结构分析和活性测定的技术研究平台,并成功得到了八个促胰岛素释放肽的一级结构,都与已报道的促胰岛素释放肽的氨基酸序列明显不同,表明均为新的生物活性肽。其中,从无指盘臭蛙（Odorranagrahami）皮肤中得到的促胰岛素释放肽数量较多,提示该种动物皮肤分泌液是一个宝贵的生物资源库,而且所得到的odorranain-Y仅仅由十一个氨基酸残基组成,是目前已发现促胰岛素释放肽中分子量最小的。促胰岛素释放肽的生理活性研究为改善Ⅱ型糖尿病患者的胰岛素分泌功能提供了新的研究方向和广阔前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语说明
• 第一章 文献综述
• 1 促胰岛素释放肽研究概况
• 2 各类促胰岛素释放肽的结构功能特点
• 2.1 肠促胰岛素
• 2.2 细菌外毒素（bacteria exotoxin）
• 2.3 鹅膏菌毒素（amanita toxins）
• 2.4 昆虫毒素（insect toxins）
• 2.5 两栖类皮肤中的促胰岛素释放肽
• 2.6 爬行类动物毒素
• 3 促胰岛素释放肽调节胰岛素分泌的分子机制
• 3.1 胰岛素的合成与分泌
• 3.2 对细胞膜的穿孔作用
• 3.3 受体介导的跨膜信号转导—近端调节
• 3.4 细胞外吐作用的调节—末端调节
• 4 促胰岛素释放肽的应用与药物开发
• 参考文献
• 第二章 促胰岛素释放肽的分离纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 皮肤分泌液收集方法
• 1.3 促胰岛素释放肽的分离纯化
• 1.4 分子量测定和纯度检验
• 1.5 多肽结构分析
• 1.6 促胰岛素释放肽的分子克隆
• 2 结果与分析
• 2.1 皮肤分泌液分离纯化的结果
• 2.2 促胰岛素释放肽的分子量测定
• 2.3 结构研究
• 2.4 分子克隆
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 促胰岛素释放肽的生理活性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 细胞培养
• 1.2 胰岛素释放活性检测
• 2+浓度[Ca²⁺]_i测定'>1.3 细胞内Ca²⁺浓度[Ca²⁺]_i测定
• 1.4 抗菌活性及作用机制
• 1.5 鸡胚尿囊绒毛膜实验（CAM assay）
• 2 结果与分析
• 2.1 胰岛素释放实验
• 2+浓度[Ca²⁺]_i测定'>2.2 细胞内Ca²⁺浓度[Ca²⁺]_i测定
• 2.3 最小抑菌浓度测定和抗菌机制研究
• 2.4 鸡胚尿囊绒毛膜实验（CAM assay）
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文、申请专利和荣誉奖项