共表达猪生长抑素基因和PRRS病毒GPS基因的质粒DNA的动物免疫试验研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是一种严重危害养猪业的传染病,主要引起母猪繁殖障碍和仔猪及生长猪呼吸系统疾病。现有的商品化疫苗（灭活疫苗和弱毒疫苗）具有一定的免疫效果,但弱毒疫苗有毒力返强的危险,灭活疫苗可能出现接种反应。因此,迫切需要研制更加安全有效的疫苗用于PRRS 的防制。PRRS病毒（PRRSV）GP5 是一种多功能蛋白,含有与病毒中和作用相关的表位,参与细胞免疫与体液免疫,在免疫反应中起重要作用。PRRSV GP5 基因被认为是亚单位疫苗、重组活载体疫苗和DNA 疫苗的首选基因。生长抑素（somatostatin,SS）是生长激素的拮抗剂,用SS 免疫动物,能促进动物生长。先前报道的基于SS 的疫苗只具有促进动物生长的单一功能。如果能开发一种既能预防PRRS又能促进动物生长的新型疫苗,将更具有经济意义和应用价值。为了探讨编码猪SS 与PRRSV GP5 融合基因的质粒DNA 是否能促进猪只生长并诱导特异性抗体,本研究扩增并克隆了SS 基因片段,构建了共表达SS 与PRRSV GP5 基因的真核表达质粒pISG-SS/GP5,并用质粒pISG-SS/GP5 与空载体pISGRTK3 分别免疫BALB/c 小鼠和仔猪。挑取15 只4 周龄雌性健康BALB/c 小鼠,随机分为3 组,每组5 只,分别肌注pISG-SS/GP5、pISGRTK3 和生理盐水,一共免疫3 次（100μg/只）,每次间隔2 周。首次免疫后第6 周和第8 周采血并分离血清,用于抗体检测。另选取体重接近的1 月龄PRRS 抗体阴性的健康断奶仔猪10 头,随机分为2 组,每组5 头,分别接种pISG-SS/GP5 或pISGRTK3。每头按600μg 剂量通过后腿肌肉（5/6 剂量）和腹股沟浅表淋巴结（1/6 剂量）注射,一共免疫3 次,每次间隔3 周。免疫前和免疫后每周定期在上午采食前采血、称重。用ELISA 和Western blot 检测免疫鼠和猪血清,结果表明,免疫鼠和猪都产生了抗PRRSV GP5 的特异性抗体。免疫猪称重结果显示,首次免疫后第19 周（试验结束）时,pISG-SS/GP5 免疫组比空载体对照组平均增重提高12.2%。本研究首次用编码SS 与PRRSV GP5 融合基因的质粒DNA 免疫猪,不但促进了猪的生长,而且诱导猪产生了特异性抗GP5 的抗体,表明DNA 疫苗可望作为一种新型的基因工程疫苗与促生长制剂,起到预防疾病和促进生长的双重作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 生长抑素与动物生长
• 1.1.1 生长抑素的分子结构
• 1.1.2 生长抑素影响动物生长的机理
• 1.1.3 生长抑素主动免疫促进动物生长
• 1.2 猪繁殖与呼吸综合征的免疫与预防
• 1.2.1 PRRSV 基因组结构及其编码的蛋白
• 1.2.2 PRRSV 感染与体液免疫
• 1.2.3 PRRSV 感染与细胞免疫
• 1.2.4 PRRSV 感染与细胞因子的产生
• 1.2.5 PRRS 灭活疫苗的研究
• 1.2.6 PRRS 弱毒疫苗的研究
• 1.2.7 PRRS 基因工程疫苗的研究
• 1.2.8 PRRS疫苗免疫佐剂的研究
• 1.3 抗病毒 DNA 疫苗的研究进展
• 1.3.1 DNA 疫苗诱导免疫应答的机制
• 1.3.2 DNA 疫苗的接种方法和途径
• 1.3.3 DNA 疫苗的细胞因子佐剂
• 1.3.4 抗原靶向 APC 的嵌合 DNA 疫苗
• 1.4 研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验动物及饲养
• 2.2 质粒和受体菌
• 2.3 主要试剂
• 2.4 主要溶液的配制
• 2.5 主要仪器设备
• 2.6 引物
• 2.7 猪外周血单个核细胞的分离
• 2.8 猪外周血单个核细胞基因组 DNA 的提取
• 2.9 生长抑素基因的扩增
• 2.10 生长抑素基因的克隆
• 2.10.1 PCR 产物的回收
• 2.10.2 PCR 产物的连接
• 2.10.3 感受态细胞制备
• 2.10.4 转化
• 2.11 阳性重组子的筛选与鉴定
• 2.11.1 裂解法提取质粒 DNA
• 2.11.2 重组子酶切及 PCR 鉴定
• 2.12 融合表达 SS 与 GP5 真核表达载体的构建
• 2.13 质粒 DNA 的大量制备
• 2.14 BALB/c 小鼠的免疫程序
• 2.15 猪的免疫程序
• 2.16 ELISA 检测免疫动物血清中抗 GP5 抗体
• 2.17 Western blot 检测免疫动物血清中抗 GP5 抗体
• 2.18 统计分析
• 3 结果
• 3.1 猪生长抑素基因的扩增
• 3.2 重组质粒pMD-SS 的鉴定
• 3.3 重组质粒pISG-GP5 的鉴定
• 3.4 重组质粒pISG-SS/GP5 的鉴定
• 3.5 免疫小鼠血清中抗 GP5 抗体检测
• 3.6 免疫猪血清中抗 GP5 抗体检测
• 3.7 猪的体重变化及统计学分析
• 4 讨论
• 4.1 DNA 疫苗的接种方法
• 4.2 动物年龄对 DNA 疫苗免疫应答的影响
• 4.3 重组疫苗诱导的 GP5 抗体与免疫保护
• 4.4 基因免疫的促生长作用
• 4.5 生长抑素融合蛋白免疫的促生长作用
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间发表的论文