酵母双杂交系统的抗HIV中草药的快速筛选

论文摘要

目的：HIV是一种反转录病毒，是艾滋病的病原体，根据2010年UNAIDS的全球报告，截止到2009年底，约有3330万人感染HIV，而死于艾滋病的人数约180万。尽管至今已采取大量的科学，社会及政治力量来限制艾滋病的流行，但是世界上几乎没有地区可以避免。更令人沮丧的是在世界上，某些地区的感染率依然在增加。现今，高效抗反转录病毒疗法（HAART）运用反转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的组合来抑制病毒的复制，在很大程度上改善了患者的临床状况，增加了患者的寿命以及生活质量。然而，除严重的副作用以及价格昂贵外，该疗法还会导致抗药物的病毒突变体的产生。总之，仍然急切需要新的高效的阻断病毒复制的药物。研究表明HIV Tat通过hcyclinT1与P-TEFb复合物结合，这个Tat/P-TEFb复合物与TAR相互作用导致RNA聚合酶ⅡC端结构域的高磷酸化，而高磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ大量延伸HIV的转录本，保证了HIV的复制。本文以P-TEFb为靶点，运用酵母双杂交技术建立了抗HIV中药的筛选模型。在酵母双杂交系统中Tat和人类cyclinT1相互作用，因此我们可通过检测药物对Tat和hcyclinT1相互作用的影响，从而快速完成对药物的筛选。方法：我们以pCDNA3-hcyclinT1和pEGFP-Tat质粒为模板，PCR扩增出人类cyclinT1和HIV Tat基因，并将其分别插入真核表达载体pGBKT7和pGADT7-Rec中，然后运用LiAc转化法将酵母双杂交载体分别转入AH109和Y187菌株中，将筛选二种的阳性克隆接合后筛选出阳性二倍体，验证出HIV Tat和人类cyclinT1蛋白相互作用，运用二倍体酵母双杂交系统筛选具有抑制两蛋白相互作用的中药。结论：成功地构建了酵母双杂交载体，建立了酵母双杂交系统，在对20种单味中药的筛选中，成功地筛选出四种能够抑制二者相互作用的中草药，为进一步进行配伍和体外（细胞内）试验证实对HIV的抑制作用奠定了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 缩略语
• 1 引言
• 1.1 艾滋病的概述
• 1.1.1 艾滋病的发现及致病性
• 1.1.2 艾滋病的病原体—HIV 的变异性
• 1.1.3 艾滋病的传播途径
• 1.1.4 艾滋病疫情现状
• 1.2 抗艾滋病药物的分类
• 1.2.1 逆转录酶抑制剂
• 1.2.2 蛋白酶抑制剂
• 1.2.3 HAART 疗法
• 1.3 抗艾滋病药物开发的新靶点—P-TEFb
• 1.3.1 抗 HIV 药物开发中的靶点
• 1.3.2 抗艾滋病药物开发的新靶点—P-TEFb
• 1.4 传统抗 HIV 药物的筛选方法及酵母双杂交系统筛选的可行性
• 1.4.1 传统抗 HIV 筛选方法的介绍
• 1.4.2 酵母双杂交系统筛选的可行性
• 1.5 中药治疗艾滋病的优势
• 1.6 本文的研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 中药
• 2.1.3 引物设计
• 2.1.4 培养基及主要试剂
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 目的基因片段的扩增
• 2.2.2 电泳检测 PCR 产物
• 2.2.3 PCR 产物纯化与回收
• 2.2.4 表达载体的构建
• 2.2.5 CaCl2法制备 DH5α感受态细胞及连接产物的转化
• 2.2.6 碱裂解法提取质粒
• 2.2.7 重组表达载体的鉴定
• 2.2.8 LiAc 法酵母菌感受态的制备及酵母转化
• 2.2.9 诱饵融合载体和猎物融合载体的自激活测定
• 2.2.10 诱饵融合蛋白在酵母中的毒性作用
• 2.2.11 酵母交配及酵母双杂交鉴定
• 2.2.12 中药筛选
• 3 实验结果
• 3.1 重组载体的构建
• 3.1.1 人 cyclinT1 和 HIV Tat 基因片段的扩增
• 3.1.2 真核表达载体的构建与鉴定
• 3.2 诱饵表达载体和猎物表达载体的自激活测定及毒性检测作用
• 3.3 酵母双杂交的鉴定
• 3.4 基于酵母双杂交的中药筛选
• 4 讨论
• 4.1 酵母双杂交筛选的优势
• 4.2 酵母双杂交筛选中草药的结果探讨
• 4.2.1 中草药筛选范围的选择
• 4.2.2 基于酵母双杂交的中草药筛选的结果分析
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位论文期间发表的研究论文目录