论文摘要
桂枝汤（由桂枝、芍药、甘草、生姜、大枣组成）是治疗太阳中风的主方，能解肌发表，调和营卫，用于外感风寒表虚证。本课题组自1985年以来，以张仲景对桂枝汤功能论述为依据，运用多种实验方法，对桂枝汤进行了深入系统的研究。其中，桂枝汤解热有效部位A（Fr．A）在很小剂量即显示了明显的解热活性，并可降低发热动物下丘脑PGE2含量，经LC／MS、GC／MS和化学分离确证，其内含十余种苯丙烯类化合物，此类化合物为该部位的主要成分。近年来已成功克隆了数个与感受温度相关的生物分子的基因，明确了它们编码的蛋白质是属于瞬变感受器电位蛋白（transient receptor potential，TRP）家族。其中，发现TRP vanilloid 4（TRPV4）可感受生理范围（＞27℃）以内的温度刺激且在下丘脑出现表达，表明TRPV4可能是下丘脑区传递温热刺激的换能装置。中药活性物质对TRP通道的作用是否参与了体温调节是值得探索的领域，我们期望能进一步阐明苯丙烯类化合物解热作用机理，从而为揭示“中药及其复方由活性物质群构成，活性物质群按一定要求配伍组合，通过机体的多靶点、多途径经整合发挥作用”的实质作出贡献。鉴于脑微血管内皮细胞和PGE2在发热反应中的重要地位，本研究论文以小鼠脑微血管内皮细胞（b．End3）为研究对象，观察桂枝汤主要有效成分苯丙烯类化合物对IL-1β刺激b．End3细胞释放PGE2的影响，计算IC50并分析其构效关系；在上述实验结果的基础上，选择抑制效果最佳的单体化合物桂皮醛作为代表药物，进行整体动物解热镇痛抗炎实验，探讨苯丙烯类化合物解热镇痛抗炎作用及解热机制；利用Realtime RT-PCR、Western blot、荧光细胞免疫化学和ELISA等多种技术方法观察桂皮醛对IL-1β刺激下b．End3细胞内TRPV4表达的影响，以期探讨PGE2释放与TRPV4的相关性。一、桂枝汤苯丙烯类化合物对IL-1β刺激b．End3细胞分泌PGE2的影响及构效关系研究本实验在以往研究桂枝汤全方或Fr．A的实验结果基础上，我们收集或合成苯丙烯类化合物共计33种进行试验，以b．End3细胞为实验对象，以不同浓度苯丙烯类化合物予以干预，ELISA方法检测细胞培养液中PGE2的含量，计算各化合物IC50并分析构效关系。结果显示苯丙烯类化合物对IL-1β刺激b．End3细胞释放PGE2具有不同程度的抑制作用，其中桂皮醛类化合物呈现出较好的抑制作用，桂皮醇类化合物次之，桂皮酸类化合物作用较差，其作用强度与侧链取代基的位置和数目密切相关，呈现一定的构效关系。二、桂皮醛对整体动物解热镇痛抗炎作用及解热机制的研究本实验以桂皮醛作为苯丙烯类化合物的代表药物，采用酵母发热大鼠模型，观察桂皮醛的解热作用；采用ELISA方法测定致热大鼠下丘脑组织PGE2含量，探讨桂皮醛解热机制；采用小鼠扭体法和热板法，观察桂皮醛镇痛作用；通过小鼠耳肿胀及对腹腔毛细血管通透性的影响观察桂皮醛抗炎作用。结果显示桂皮醛能显著减轻酵母所致大鼠发热反应；显著降低发热大鼠下丘脑PGE2含量；明显提高热板痛阈和抑制醋酸所致扭体反应；亦能显著抑制腹腔毛细血管通透性的增高及二甲苯所致小鼠耳廓肿胀。提示，桂皮醛具有明显的解热镇痛抗炎作用，其解热机制可能与影响下丘脑PGE2含量有关。三、桂皮醛解热机制——PGE2释放与TRPV4相关性的探讨本实验以b．End3细胞为研究对象，以桂皮醛和TRPV4通道的阻断剂钌红（ruthenium red，RR）预处理后，用30ng·mL-1的IL-1β刺激，应用Realtime RT-PCR技术测定TRPV4 mRNA表达变化，用Western blot技术和荧光免疫细胞化学技术检测其蛋白表达水平，并同步测定细胞上清中PGE2含量的变化，以期观察PGE2释放与TRPV4的相关性。实验结果显示b．End3细胞中存在TRPV4 mRNA和蛋白表达，IL-1β可增高b．End3细胞TRPV4 mRNA和蛋白的表达；钌红可显著降低正常和IL-1β刺激下b．End3细胞TRPV4 mRNA和蛋白的表达；桂皮醛(0.38mmol·L-1)可降低IL-1β刺激下b．End3细胞TRPV4 mRNA和蛋白的表达，但作用弱于钌红。ELISA法同步测定细胞上清中PGE2含量，结果显示IL-1β刺激后b．End3细胞培养液中的PGE2的含量显著升高，与对照组比较有显著差异。桂皮醛显著降低细胞的培养液中PGF2含量，而钌红对正常和IL-1β刺激后细胞的培养液中PGE2含量均无明显改变。综上可见，TRPV4并不直接参与PGE2释放，其参与体温调节作用可能通过其它通路实现。桂皮醛影响b．End3细胞内TRPV4表达可能通过直接或间接的抑制作用，但其具体机制以及TRPV4参与体温调节的其他通路，还有待于进一步的研究。
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