华根霉（Rhizopus chinensis）前导肽和成熟肽脂肪酶在E.coli中的克隆表达和酶学性质研究

论文摘要

根霉脂肪酶是一类典型的微生物脂肪酶,其独特的催化特性使其在脂肪酶理论研究和实际应用中都占有重要地位。华根霉脂肪酶（Rhizopus chinensis lipase, RCL）在酯类物质的合成、生物柴油和手性化合物的制备等重要工业实践中表现出良好的应用价值。对华根霉脂肪酶进行克隆表达以及酶学性质研究,为进一步开展华根霉脂肪酶的理论和应用研究提供了一定基础。为了较全面的认识华根霉脂肪酶,准确表达不同脂肪酶的基因片段,指导其工业应用,本文从华根霉（Rhizopus chinensis CCTCCM201021）基因组中PCR扩增出前导肽脂肪酶基因（proRCL）和成熟肽脂肪酶基因（mRCL）并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒,并在E.coli BL21中实现了具有活性的表达,表达产物SDS-PAGE分析表明,表达的前导肽脂肪酶分子量约43 kD,成熟肽脂肪酶分子量约33 kD,与预期分子量相同。优化表达条件,能获得活性相对较高的重组蛋白。收集菌体,超声破碎上清液经镍离子亲和层析,纯化得到目的蛋白。对重组ProRCL和MRCL主要酶学性质进行了研究,发现ProRCL和MRCL最适反应温度相同,为35℃,最适反应pH相近,分别为8.0和8.5。两重组脂肪酶水解底物的脂肪酸链长特异性差别不大,均对短链的脂肪酸酯水解活力较高,分类学上更接近于酯酶。但底物动力学常数有差异,分别以长链的对硝基苯酚棕榈酸酯和短链的对硝基苯酚丙酸酯为底物,ProRCL和MRCL的Km值说明两脂肪酶对对硝基苯酚丙酸酯的结合能力明显高于对硝基苯酚棕榈酸酯,其Kcat值也说明短链的对硝基苯酚丙酸酯为较适底物。10 mmol/L的Mg2+对两重组脂肪酶有较好的激活作用,而Hg2+、SDS和PMSF强烈抑制其活力。与米根霉脂肪酶（ROL）不同,研究结果表明,前导序列对华根霉脂肪酶的主要酶学特性没有显著影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 脂肪酶概述
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 脂肪酶分子生物学研究进展
• 1.2.2 根霉脂肪酶的克隆表达
• 1.3 根霉脂肪酶的应用
• 1.4 本课题研究背景、意义和课题来源
• 1.5 本课题研究内容
• 1.5.1 本课题研究思路
• 1.5.2 研究方法
• 1.5.3 研究内容
• 第二章 华根霉脂肪酶基因的克隆及表达载体的构建
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株与质粒
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 培养基与溶液
• 2.2.4 主要仪器
• 2.2.5 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 华根霉基因组DNA 的提取
• 2.3.2 proRCL、mRCL 基因的PCR 扩增
• 2.3.3 pMD19-proRCL 及pMD19-mRCL 克隆质粒的构建
• 2.3.4 重组表达质粒的构建
• 2.4 本章小结
• 第三章 华根霉前导肽和成熟肽脂肪酶的表达优化和纯化
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株与质粒
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 培养基与溶液
• 3.2.4 主要仪器
• 3.2.5 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 pET28-proRCL 和pET28-mRCL 的初步表达
• 3.3.2 ProRCL 和MRCL 的优化表达
• 3.3.3 目的蛋白的纯化
• 3.4 本章小结
• 第四章 重组脂肪酶的酶学性质研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 pH 对重组脂肪酶活力的影响
• 4.3.2 pH 对重组脂肪酶稳定性的影响
• 4.3.3 温度对重组脂肪酶活性的影响
• 4.3.4 温度对重组脂肪酶稳定性的影响
• 4.3.5 重组脂肪酶的脂肪酸链长专一性
• 4.3.6 金属离子、鳌合剂等对重组脂肪酶活力的影响
• 4.3.7 重组脂肪酶的有机溶剂稳定性
• 4.3.8 重组脂肪酶的动力学常数
• 4.4 本章小结
• 主要结论
• 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1：作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录2: 基因序列测定