防治马尾松毛虫绿僵菌的应用基础研究

论文摘要

本文主要针对绿僵菌对马尾松毛虫致病菌株的筛选及影响致病力的温湿度因子、马尾松毛虫对绿僵菌入侵的生理反应、绿僵菌培养与菌种稳定性、绿僵菌与化学杀虫剂、白僵菌混配及其增效作用和绿僵菌对林间节肢动物群落多样性的影响等方面进行了较为系统的研究,旨在揭示绿僵菌对马尾松毛虫的生物控制潜能,为有效利用绿僵菌防治马尾松毛虫提供理论依据。现将主要研究结果摘要如下:1.供试的9个绿僵菌菌株(M103、M104、M131、M337、M187、M336、M115、M335和M189)中,金龟子绿僵菌M104和M337菌株对马尾松毛虫有致病性,进一步对这2个菌株进行生物测定表明,M337菌株的毒力高于M104菌株,M337菌株对马尾松毛虫有较高毒力。通过对致病菌株M104和M337生物学特性的研究,明确了它们生长发育所需要的营养条件、环境条件和分生孢子萌发的营养和环境条件。2个致病菌株对环境条件有较好的适应性,25～28℃、pH6.5～7.0为适宜的产孢条件;温度、湿度和pH显著影响分生孢子萌发,25～28℃,pH6.5～7.5,RH＞92.5%是分生孢子的最适萌发条件。比较而言,M337菌株比M104菌株的产孢量大、孢子萌发快、萌发率高,对温度、湿度等环境条件的适应力更强,表现出更好的开发应用潜力。2.以筛选出的绿僵菌M337和M104菌株为研究对象,对其致病力及温湿度影响因子与白僵菌(Bb01和Bb02菌株)进行比较。研究结果表明,绿僵菌M337菌株与白僵菌Bb01、Bb02菌株对马尾松毛虫的毒力相当,但绿僵菌M104菌株对马尾松毛虫的毒力低于白僵菌Bb01和Bb02菌株。与供试的白僵菌菌株相比,绿僵菌分生孢子具有较好的耐高温和耐旱性,在高温和低湿的条件下,绿僵菌的杀虫效果优于白僵菌。林间防治结果显示,绿僵菌对第1代马尾松毛虫的防治效果显著优于白僵菌,显示了较好的应用前景。3.马尾松毛虫对绿僵菌入侵的生理反应试验表明,幼虫被绿僵菌感染后1～4d,血淋巴中血细胞总数和可溶性蛋白浓度均显著高于同期未感染的幼虫。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,分析了感染后3d、4d、6d幼虫体壁组织中可溶性蛋白和过氧化物酶,以及血淋巴中过氧化物酶的变化。结果显示,绿僵菌的侵染对寄主昆虫的蛋白质代谢产生影响,过氧化物酶活性有减弱趋势。4.通过对金龟子绿僵菌M337菌株液固两相发酵技术的研究,优化控制发酵过程,筛选出玉米粉（2份）+麦麸（2份）+谷壳（2份）为固体发酵培养基的优化配方,液体种子发酵周期72h,初始接种量控制在25%为宜。保持培养温度25～28℃和环境湿度83～94%左右,同时选择合适的覆盖物可降低杂菌的污染。固态发酵周期11d,菌粉干燥温度控制在35℃,时间24h,可缩短生产周期。此外,研究了2种含铜化学杀菌剂（30%氧氯化铜和耐克铜）对绿僵菌生长、产孢的影响和对杂菌的抑制作用,在0.05%～0.15%浓度范围内,2种杀菌剂对金龟子绿僵菌的菌落形成没有明显影响。而耐克铜在0.05%～0.15%浓度时能显著地增加金龟子绿僵菌的产孢量,并有缩短产孢时间的作用。研究还表明2种杀菌剂对杂菌（根霉、曲霉和青霉）有较强的抑制作用,并随着浓度的增大,抑制作用迅速增强。试验结果对绿僵菌菌剂生产具有重要意义。5.对6个绿僵菌菌株(M337、M103、M104、M115、M335和M336)的液体深层培养研究表明,绿僵菌M337、M103、M104、M115菌株能通过微循环产孢方式形成液生分生孢子,微循环产孢现象的发生与菌株有一定的相关性。绿僵菌在固体和液体培养中产生不同形态的分生孢子,绿僵菌M337菌株在液体培养条件下产生的液生分生孢子为单孢、卵圆形到近球形,大小3.17～4.51μm×2.51～3.34μm,与气生分生孢子有明显差异。以M337菌株为对象研究了在液体深层培养条件下绿僵菌生长和产孢的营养和环境条件。研究结果表明,绿僵菌液生分生孢子的形成与培养基成分密切相关。不同的碳、氮源对液生分生孢子形成具有显著影响。蔗糖是液体深层培养液生分生孢子的理想碳源,而花生饼粉、豆饼粉则是较理想的氮源,且液生分生孢子的产量与培养基氮源的性质有关,复杂的氮源比简单的氮源更有利于液生分生孢子的形成。在供试的8种碳源和6种氮源相互组配的培养液中,以蔗糖+花生饼粉的组合最佳,液生分生孢子产量达14.13×109个孢子·L-1。同时,液生分生孢子的形成比率与培养液的碳氮比有关,培养液的C/N为3:1时,可使液生分生孢子的产出率最高。微量元素和维生素对促进绿僵菌液生分生孢子的形成具有重要影响。Mo为最重要的影响元素,其次是Zn,而B、Cu、Fe、Mn、Mo、Zn的协同作用将有力促进液生分生孢子的产生。在培养基中添加VB6+VH或复合维生素B能有效促进绿僵菌液生分生孢子的形成。不同的氨基酸对绿僵菌生长及液生分生孢子形成影响很大,天门冬酰胺和L-丙氨酸有利于液生分生孢子的形成。光照对绿僵菌生长和液生分生孢子产量均无显著影响。但培养温度显著影响其生物量和液生分生孢子的产出率。25～28℃为适宜的培养温度,但28℃时液生分生孢子的产量最高。同时,培养液的pH也显著影响绿僵菌的生长和产孢,以pH6.5～6.8为宜,但pH6.8时产孢量最大。对3株绿僵菌(M337、M103和M115)在不同含量的吐温80培养液中进行液体深层培养研究表明,吐温80对绿僵菌液生分生孢子的形成具有显著的影响,培养基中吐温80含量在0.6～1.0%之间时,可获得最大的产孢量。磁化水对供试的3株金龟子绿僵菌(M337、M103、M104)和1株贵州绿僵菌(M115)的液生分生孢子形成影响显著,但对生物量无显著影响。适当磁化强度的磁化水能显著提高绿僵菌M337和M103菌株的液生分生孢子产量,但试验也显示不同菌株对磁化水的生物效应表现出明显的差异性。对马尾松毛虫毒力的生物测定显示,绿僵菌M337菌株的液生分生孢子对马尾松毛虫具有较高的侵染力,仅比气生分生孢子的毒力略低。因此,绿僵菌液体发酵有进一步研究的价值。6.对金龟子绿僵菌M337菌株进行继代培养,探讨了6种常见培养基、4种碳源和氮源以及6个碳氮组合培养基对菌种稳定性、产孢量、毒力的影响。结果显示,绿僵菌的变异虽然主要受控于菌株自身的遗传特性,但同时也受培养基组成性质的影响。常见的6种培养基以营养贫乏的CMA和WBA最易发生变异,PPDA较稳定。动物性氮源较植物性氮源稳定,以麦芽糖和乳糖为碳源比较稳定。在不同碳氮比试验中,供试菌株在C/N比为2:1的培养基上比较稳定。7.对8种化学杀虫剂（4.5%高效顺反氯氰菊酯乳油、2.5%敌杀死乳油、21%灭杀毙乳油、25%灭幼脲Ⅲ悬浮剂、20%杀灭菊酯乳油、40%氧化乐果乳油、40%辛硫磷乳油和18%杀虫双水剂）与绿僵菌M337、M103、M104、M115、M335和M336菌株的相容性以及菌药混配的增效作用进行研究,结果表明,供试的8种化学杀虫剂皆对绿僵菌分生孢子有程度不同的抑制作用,浓度愈高,抑制作用愈强,但次亚致死剂量对分生孢子萌发抑制作用较小。对马尾松毛虫的生物测定结果显示,M337+杀灭菊酯（80000×）、M337+敌杀死（60000×）、M337+辛硫磷（10000×）、M337+灭杀毙（25000×）、M337+灭幼脲Ⅲ（15000×）,其LT50比单用绿僵菌M337(1.9×1010个孢子·L-1)分别缩短了9d、7d、6d、5d和3d,增效作用明显。8.绿僵菌和白僵菌混合使用经共毒系数分析,对马尾松毛虫幼虫的毒力增加了1.78倍。林间防治试验结果也表明,绿僵菌与白僵菌混合使用对马尾松毛虫的防治效果显著优于单独使用绿僵菌和白僵菌,增效作用明显。9.在施用绿僵菌菌剂前后,通过对马尾松毛虫虫口密度的T测验、节肢动物群落的垂直分布格局及马尾松林群落特征参数的分析,结果表明,绿僵菌对马尾松毛虫的种群控制作用明显,对非目标无脊椎动物不具有明显的影响,并且改善了整个马尾松林节肢动物群落的多样性和稳定性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 绿僵菌分类现状
• 1.2 绿僵菌生物学
• 1.3 绿僵菌对昆虫的致病机理
• 1.4 寄主昆虫防御体系
• 1.5 绿僵菌发酵生产
• 1.6 绿僵菌剂型开发应用
• 1.7 绿僵菌商品化与应用
• 1.8 我国应用绿僵菌防治农林害虫的研究概况
• 2 本项目研究的意义
• 2.1 马尾松毛虫的危害性
• 2.2 马尾松毛虫的主要天敌
• 2.3 当前治理马尾松毛虫的主要技术措施
• 2.4 利用绿僵菌防治马尾松毛虫的研究现状
• 2.5 本项目研究的意义
• 3 研究的主要内容和技术路线
• 第一章 绿僵菌菌株筛选及其生物学特性
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌种及供试昆虫
• 1.2 绿僵菌致病菌株筛选
• 1.3 营养条件对绿僵菌生长发育的影响
• 1.3.1 试验室常用培养基对绿僵菌营养生长和产孢的影响
• 1.3.2 不同碳源对绿僵菌产孢的影响
• 1.3.3 不同氮源对绿僵菌产孢的影响
• 1.3.4 培养基不同C/N比对绿僵菌产孢的影响
• 1.4 环境条件对绿僵菌产孢的影响
• 1.4.1 温度对绿僵菌产孢的影响
• 1.4.2 光照对绿僵菌产孢的影响
• 1.4.3 pH对绿僵菌产孢的影响
• 1.5 营养条件对分生孢子萌发的影响
• 1.5.1 碳源对绿僵菌孢子萌发的影响
• 1.5.2 氮源对绿僵菌孢子萌发的影响
• 1.5.3 油类物质对绿僵菌孢子萌发的影响
• 1.6 环境条件对分生孢子萌发的影响
• 1.6.1 温度对绿僵菌孢子萌发的影响
• 1.6.2 湿度对绿僵菌孢子萌发的影响
• 1.6.3 pH对绿僵菌孢子萌发的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 绿僵菌菌株筛选
• 104和M₃₃₇菌株生长发育的影响'>2.2 营养条件对M₁₀₄和M₃₃₇菌株生长发育的影响
• 104和M₃₃₇菌株营养生长和产孢的影响'>2.2.1 不同培养基对M₁₀₄和M₃₃₇菌株营养生长和产孢的影响
• 2.2.2 不同碳源对产孢的影响
• 2.2.3 不同氮源对产孢的影响
• 2.2.4 不同C/N比对产孢的影响
• 104和M₃₃₇菌株产孢的影响'>2.3 环境条件对M₁₀₄和M₃₃₇菌株产孢的影响
• 2.3.1 温度对产孢的影响
• 2.3.2 光照对产孢的影响
• 2.3.3 pH对产孢的影响
• 2.4 营养条件对分生孢子萌发的影响
• 2.4.1 碳源对孢子萌发的影响
• 2.4.2 氮源对孢子萌发的影响
• 2.4.3 油类物质对孢子萌发的影响
• 2.5 环境条件对分生孢子萌发的影响
• 2.5.1 温度对孢子萌发的影响
• 2.5.2 湿度对孢子萌发的影响
• 2.5.3 pH对绿僵菌孢子萌发的影响
• 3 讨论
• 第二章 绿僵菌对马尾松毛虫的致病力
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌种及供试昆虫
• 1.2 生物测定
• 1.3 数据处理
• 1.4 不同温度和湿度下绿僵菌和白僵菌致病力比较
• 1.5 不同温度和湿度下绿僵菌和白僵菌分生孢子萌发力比较
• 1.6 林间防治试验
• 2 结果与分析
• 2.1 绿僵菌和白僵菌对马尾松毛虫的毒力比较
• 2.1.1 时间—剂量—死亡率模型
• 2.1.2 各时段的毒力
• 2.1.3 致死浓度（LC）比率测定
• 2.2 不同温湿度下绿僵菌和白僵菌致病力比较
• 2.3 不同温湿度下绿僵菌和白僵菌分生孢子萌发力比较
• 2.4 绿僵菌和白僵菌林间防治效果比较
• 3 小结与讨论
• 第三章 马尾松毛虫对绿僵菌入侵的生理反应
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌种和虫源
• 1.2 绿僵菌感染方法
• 1.3 血细胞总数的测定
• 1.4 血淋巴可溶性蛋白浓度的测定
• 1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2 结果与分析
• 2.1 血淋巴中血细胞总数和可溶性蛋白浓度的变化
• 2.2 体壁组织可溶性蛋白组份的变化
• 2.3 血淋巴和体壁组织过氧化物酶的变化
• 3 讨论
• 第四章 绿僵菌分生孢子培养
• 第一节 液固两相培养
• 1 培养参数优化控制
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 供试菌种
• 1.1.2 液体种子培养基及液体种子制备
• 1.1.3 浅盘发酵培养基的筛选
• 1.1.4 固体发酵浅盘的消毒及接种
• 1.1.5 接种量对产孢的影响
• 1.1.6 液体种子发酵时间
• 1.1.7 培养温度对产孢的影响
• 1.1.8 培养环境湿度对产孢的影响
• 1.1.9 浅盘培养覆盖方式对产孢的影响
• 1.1.10 产孢高峰的测定
• 1.1.11 菌剂烘干处理
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 浅盘发酵培养基的筛选
• 1.2.2 接种量对产孢的影响
• 1.2.3 液体种子发酵时间
• 1.2.4 培养温度对产孢的影响
• 1.2.5 环境湿度对产孢的影响
• 1.2.6 浅盘培养覆盖方式对产孢的影响
• 1.2.7 产孢高峰的测定
• 1.2.8 菌剂烘干处理
• 1.3 小结与讨论
• 2 含铜杀菌剂对绿僵菌产孢的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 化学杀菌剂来源及配制浓度
• 2.1.2 供试菌株
• 2.1.3 杀菌剂对分生孢子萌发和产孢影响测定
• 2.1.4 杀菌剂对菌落生长影响和对杂菌的抑制作用
• 2.1.5 浅盘生产试验
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 杀菌剂对绿僵菌分生孢子萌发的影响
• 2.2.2 杀菌剂对绿僵菌菌落生长的影响
• 2.2.3 杀菌剂对绿僵菌产孢的影响
• 2.2.4 杀菌剂对杂菌的抑制作用
• 2.3 讨论
• 第二节 液体深层培养
• 1 液生分生孢子产孢菌株筛选
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 供试菌种
• 1.1.2 培养基成分
• 1.1.3 试验方法
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 液体培养产物形成过程及微循环产孢现象
• 1.3 小结
• 2 液生分生孢子形成条件
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试菌种
• 2.1.2 基础培养基成分
• 2.1.3 碳氮源组合对液生分生孢子形成的影响
• 2.1.4 碳氮含量对液生分生孢子形成的影响
• 2.1.5 微量元素对液生分生孢子形成的影响
• 2.1.6 生长辅助物质对液生分生孢子形成的影响
• 2.1.7 氨基酸对液生分生孢子形成的影响
• 2.1.8 温度和光照对液生分生孢子形成的影响
• 2.1.9 pH对液生分生孢子形成的影响
• 2.1.10 接种和培养
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同培养时间液生分生孢子产量变化
• 2.2.2 碳氮组合对液生分生孢子形成的影响
• 2.2.3 碳氮含量对液生分生孢子形成的影响
• 2.2.4 微量元素对液生分生孢子形成的影响
• 2.2.5 生长辅助因子对液生分生孢子形成的影响
• 2.2.6 氨基酸对液生分生孢子形成的影响
• 2.2.7 温度和光照对液生分生孢子形成的影响
• 2.2.8 pH对液生分生孢子形成的影响
• 2.3 小结与讨论
• 3 吐温80对绿僵菌液生分生孢子形成的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试菌种
• 3.1.2 培养基配制
• 3.1.3 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 吐温80培养液中菌体发育情况
• 3.2.2 吐温80对生物量及液生分生孢子形成的影响
• 3.3 小结与讨论
• 4 磁化水对绿僵菌液生分生孢子形成的影响
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 供试菌种
• 4.1.2 磁化水生产
• 4.1.3 培养基成分
• 4.1.4 试验方法
• 4.2 结果和分析
• 4.2.1 磁化水对液生分生孢子形成和生物量的影响
• 4.3 小结与讨论
• 5 液生分生孢子对马尾松毛虫的毒力
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 供试菌种及供试昆虫
• 5.1.2 培养液成分
• 5.1.3 毒力测定
• 5.1.4 数据处理
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 生测试验概况
• 5.2.2 时间—剂量—死亡率模型
• 5.2.3 各时段的毒力
• 5.3 讨论
• 第五章 绿僵菌菌种稳定性
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 生产速率与产孢量测定
• 1.4 生物测定
• 2 结果与分析
• 2.1 菌落局变现象
• 2.2 不同培养基对生长速率与产孢量的影响
• 2.3 碳源对生长速率与产孢量的影响
• 2.4 氮源对生长速率与产孢量的影响
• 2.5 C/N比对生长速率与产孢量的影响
• 2.6 致病力的变化
• 3 小结与讨论
• 第六章 绿僵菌与化学杀虫剂、白僵菌混配及其增效作用
• 第一节 绿僵菌与化学杀虫剂混配及其增效作用
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌种和供试昆虫
• 1.2 化学杀虫剂及配制浓度
• 1.3 分生孢子萌发力测定
• 1.4 生物测定
• 2 结果与分析
• 2.1 化学杀虫剂对绿僵菌分生孢子萌发率的影响
• 103菌株萌发率的影响'>2.1.1 化学杀虫剂对M₁₀₃菌株萌发率的影响
• 104菌株萌发率的影响'>2.1.2 化学杀虫剂对M₁₀₄菌株萌发率的影响
• 115菌株萌发率的影响'>2.1.3 化学杀虫剂对M₁₁₅菌株萌发率的影响
• 335菌株萌发率的影响'>2.1.4 化学杀虫剂对M₃₃₅菌株萌发率的影响
• 336菌株萌发率的影响'>2.1.5 化学杀虫剂对M₃₃₆菌株萌发率的影响
• 337菌株萌发率的影响'>2.1.6 化学杀虫剂对M₃₃₇菌株萌发率的影响
• 2.2 菌药混用的增效作用
• 3 讨论
• 第二节 绿僵菌与白僵菌混配及其增效作用
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌种及供试昆虫
• 1.2 绿僵菌和白僵菌混剂联合毒力测定
• 1.3 林间防治试验
• 2 结果与分析
• 2.1 绿僵菌和白僵菌混剂联合毒力作用
• 2.2 绿僵菌和白僵菌及其混剂林间防治越冬代马尾松毛虫效果比较
• 3 小结与讨论
• 第七章 绿僵菌对马尾松林节肢动物群落多样性的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 样地设置情况及林分状况
• 1.2 调查方法
• 1.2.1 马尾松毛虫虫口密度调查
• 1.2.2 节肢动物群落多样性调查
• 1.3 群落参数的分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 施菌前后马尾松毛虫种群动态
• 2.2 施菌前后各施菌区节肢动物群落空间垂直分布格局
• 2.3 施菌前后各施菌区群落特征
• 3 讨论
• 第八章 结论与创新点
• 1 结论与讨论
• 2 本研究的主要创新点
• 3 研究工作的不足之处
• 参考文献
• 致谢