NOS1基因的多态性与荷斯坦奶牛生产性能的相关性研究

论文摘要

试验第一部分,根据氧化应激的机制,选取与氧化应激有着密切联系的一氧化氮合成酶基因（NOS）的三种亚型作为研究对象：神经性NOS1（nNOS）、诱导性N0S2（iNOS）和内皮型N0S3（enos）,采用常规的分生物学方法PCR-SSCP来检测目的基因部分外显子的是否存在SNP,采用PCR-RLFP将检测到的突变位点其分成不同的基因型,通过统计分析,比较不同的基因型在1—3胎次水平上对生产性能的影响,同时比较在热应激情况下,不同基因型与乳房炎的易感性之间的相关性。找出优势基因型。第二部分主要研究奶牛的生产寿命与哪些因素有关。通过试验我们得到了以下一些结论：（1）NOS2第27外显子和NOS3第26号外显子比较保守,在样本群中未发现突变,只在NOS1第一号外显子上发现了两个突变,位于NOS1第一号外显子371bp处和399bp处,分别产生了A→G突变和C→T突变。通过与WWW.ensembl.com已提交的突变序列比对,这是本试验发现的两个新的突变。第一个突变导致Arg→His,第二个突变未导致氨基酸突变,通过分析,第一个位点处于哈代—温伯平衡,第二个位点不处于哈代—温伯平衡,将第一个位点采用HaeⅢ内切酶进行酶切,分成AA、AG和GG三种基因型,第二个位点采用A1u I进行酶切,分成CC.CT和TT三种基因型。然后进行统计分析。（2）通过统计分析可知影响奶牛生产性能的因素很多,不同的胎次、产犊年、产犊季节以及基因型效应对荷斯坦奶牛的生产性状都会有影响,在日平均产奶量和305DM这两个观测值上,第二、三胎次的要显著高于第一胎（P<0.05）；秋季和夏季产犊的奶牛日平均产奶量要显著高于春季和冬季（P<0.05）,不同因子的水平组合也会有不同的表现,第三胎次产犊季节在秋季奶牛的乳脂率要明显高于其他因素水平组合。（3）将NOS1 exonl-HaeⅢ突变位点的三种基因型与生产性状观测值之间进行相关性分析,得出exon1-HaeⅢ不同基因型在第一胎次的水平上,对各观测值没有显著影响。通过关联分析可知在第二个胎次的水平上,AA型比AG.GG型具有更高的日平均泌乳量（P<0.05）,AG型和GG型差异不显著；在SCS这一观测值上,AA<AG（P<0.05）,AG型与GG型之间差异不显著；在305DM这一观测值上AA>AG, AA>GG且差异性显著（P<0.05）。在第三个胎次的水平上,关于体细胞评分这一观测值,AA< GG,AA<AG,且差异性显著（P<0.05）,AG与GG型之间没有差异；在乳蛋白率这一观测值上,三种基因型之间没有显著性差异,但是AG和GG有大于AA的趋势。通过对比三种基因型春夏两季之间SCS变化的差异性,发现AA、AG型春夏SCS之间的差异性不显著,GG型夏季的SCS明显高于春季且差异性显著（P<0.05）,SCS越大,往往提示奶牛的乳房健康状况越差,由此可以得出GG型夏季对乳房炎的易感性要大于AA, AG型,GG型属于易感性基因型（4）分别将NOS1 exonl-Alu I突变位点的三种基因型与生产性状指标之间进行相关性分析,结果表明三种基因型对不同的胎次各观测值没有显著影响,但是在第一胎次水平上,CT和TT型的乳蛋白率有高于CC的趋势；三种基因型与春夏两季SCS之间的变化没有相关性。（5）奶牛第一胎产犊的难易对生产寿命没有显著的影响；奶牛的第一胎的产犊季节在秋季比春季有更长的生产寿命的趋势,同样秋季比夏季有相同趋势；秋季与冬季相比有更长的生产寿命,且差异性显著（P<0.05）；春、夏、冬季之间的差异性不显著。因此奶牛的第一胎的产犊季节在秋季的个体拥有更长的生产寿命。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 氧化应激与自由基
• 1.2.1 氧化应激的概念
• 1.2.2 自由基的概念
• 1.2.3 自由基的产生
• 1.2.4 生物体内存在的自由基分类
• 1.2.5 机体内氧化还原水平的检测
• 1.3 奶牛氧化应激产生的相关因素
• 1.3.1 疾病
• 1.3.2 生理代谢
• 1.3.3 环境因素
• 1.3.4 日粮因素损伤
• 1.4 氧化应激的危害
• 1.4.1 氧化应激与DNA损伤
• 1.4.2 氧化应激与细胞凋亡
• 1.4.3 氧化应激与动物的繁殖性状
• 1.4.4 氧化应激与动物性产品的品质的影响
• 1.4.5 氧化应激与乳房炎
• 1.5 NOS基因的介绍
• 1.6 分子标记的发展简介
• 1.6.1 PCR-RFLP标记
• 1.6.2 SSCP标记
• 第二章 本研究的目的与意义
• 第三章 实验材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 血液样品
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 常用试剂
• 3.1.4 主要试剂的配制
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 奶牛血液中提取DNA的方法一（经典氯仿异戊醇法）
• 3.2.2 PCR扩增的引物的设计
• 3.2.3 PCR所采用的体系和程序
• 3.2.4 PCR产物的检验
• 3.2.5 SSCP（聚丙烯酰胺凝胶电泳实验）
• 3.2.6 疑似突变样本的PCR产物的回收
• 3.2.7 序列测定
• 3.2.8 数据统计分析
• 第四章:结果与分析
• 4.1 NOS1外显子的PCR-SSCP检测和PCR-RLFP分析
• 4.1.1 NOS1外显子的PCR实验引物设计
• 4.1.2 NOS1基因目的片段PCR反应所采用的体系:总体系20ul
• 4.1.3 NOS1基因目的片段PCR反应所采用的程序
• 4.1.4 NOS1 exon1第一段目的片段PCR—SSCP检测
• 4.1.5 NOS1 exon1第二段目的片段PCR—SSCP
• 4.1.6 NOS1 exon1第一个突变位点的PCR-RFLP实验
• 4.1.7 NOS1 exon1第二个突变位点的PCR-RFLP实验
• 4.1.8 NOS1 exon1第三段段目的片段的SSCP检测
• 4.1.9 NOS1 exon1第四段目的片段的SSCP检测
• 4.2 NOS2 EXON27的PCR-SSCP检测
• 4.3 NOS3 EXON26的PCR-SSCP检测
• 4.4 统计分析
• 4.4.1 荷斯坦奶牛NOS1 exon1-HaeⅢ多态性位点在牛群中的基因型频率和等位基因频率及遗传相关分析
• 4.4.2 奶牛不同胎次之间生产性能的部分DHI指标的比较
• 4.4.3 NOS1 exon1-HaeⅢ不同基因型与季节性热应激的SCS变化之间的联系性
• 4.4.4 NOS1 exon1-Alu Ⅰ突变位点在牛群中的基因型频率和等位基因频率的结果如下
• 4.4.5 NOS1 exon1-Alu Ⅰ突变位点的不同基因型与生产性状指标之间的关联分析
• 4.4.6 NOS1 exon1-Alu Ⅰ不同基因型与季节性气温差异导致的SCS变化之间的联系性
• 4.5 讨论
• 4.5.1 试验的准备阶段工作对试验的影响
• 4.5.2 试验方法对试验结果的影响
• 4.5.3 NOS基因家族本身的性质
• 4.5.4 奶牛生产性能受多种因素影响
• 4.4.5 奶牛氧化应激模型的建立
• 第五章 影响奶牛生产寿命因素的初步研究
• 5.1 背景介绍
• 5.2 实验材料和方法
• 5.3 统计与分析
• 5.3.1 奶牛第一胎的的产犊状况对奶牛生产寿命的统计分析结果
• 5.3.2 奶牛的第一胎产犊的季节对奶牛生产寿命的影响
• 5.4 讨论
• 第六章 全文总结
• 6.1 主要的研究成果
• 6.2 主要创新点
• 6.3 后续的工作
• 参考文献
• 致谢