猪ADAMTS1基因的克隆、定位、表达规律、遗传效应和调控机理的研究

论文摘要

含凝血酶敏感蛋白模体的去解联金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinasewith thrombospondin motifs-1,ADAMTS1）是一种存在于哺乳动物和无脊椎动物中的细胞外金属蛋白酶。研究发现ADAMTS1基因通过孕酮受体信号途径在卵泡中发挥着重要的作用。在ADAMTS1基因敲除的雌性小鼠中,发现雌性生殖器官畸形和不能完成排卵等现象。同时发现其在卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocytecomplexes,COC）的扩张过程中发挥着重要的作用。以上现象说明ADAMTS1基因是卵泡破裂过程中的关键因素并以蛋白酶的角色控制着排卵。因此,本研究对猪ADAMTS1基因进行了分离和定位,并对其表达规律、遗传效应和调控机理进行了研究,取得了以下结果:（1）根据与人ADAMTS1基因有较高同源性的猪EST以及人和小鼠ADAMTS1cDNA相似性较高的区域设计引物,以梅山猪DNA作为模板扩增、克隆并测序,拼接后获得9026 bp的整合DNA序列,包含全部CDS和内含子以及部分5’和3’非翻译区。ADAMTS1基因GenBank登录号为DQ177331。（2）利用Clustal X、ORF Finder、Signal P2.0、ANTHEPORT、PSORTⅡ、TMoreo等软件对猪ADAMTS1基因结构、编码的蛋白质结构、功能等特征进行了预测和分析。通过生物信息学分析,预测猪ADAMTS1蛋白铆定在细胞膜上,没有跨膜区域,拥有一个解联蛋白区,一个包含锌指结构的金属蛋白酶区和三个血小板反应蛋白结构、两个潜在的糖基化位点并存在很多半胱氨酸残基。（3）根据猪ADAMTS1基因DNA序列设计引物,利用猪辐射杂种克隆板（ImpRH）将猪ADAMTS1基因定位于13号染色体SSC13q49。两点连锁分析发现与猪ADAMTS1基因连锁最紧密的标记是S0215（LOD=14.18）。（4）根据已获得的DNA序列设计引物,分别以大白和梅山猪DNA作为模板进行扩增、克隆并测序。经序列比对,发现了2个SNP,第7外显子72bp处出现碱基C/G颠换,导致622位氨基酸由精氨酸变为脯氨酸;第7内含子512bp处出现碱基G/A转换,据此建立适宜的PCR-RFLP SNP分型方法。（5）利用所建立的PCR-RFLP检测方法,对猪ADAMTS1基因的2个SNP在7个中外猪群体中进行基因型分型,分析了它们的基因型频率和基因频率;并在116头新清平母猪中进行了与产仔数和产活仔数性状的关联性分析,结果表明这两个标记均与猪产仔数和产活仔数性状存在显著或极显著相关。（6）在组织和细胞水平分析了猪ADAMTS1基因的表达模式,结果表明:猪ADAMTS1基因受促性腺激素的诱导,在排卵前卵泡颗粒细胞中瞬时表达。在细胞水平分析了猪孕酮受体（progesterone receptor,PR）基因的表达模式,结果表明:猪孕酮受体基因受促性腺激素的诱导,在ADAMTS1基因表达之前在卵泡颗粒细胞中瞬时表达。利用Western blot检测PR在卵巢颗粒细胞中的表达,证实在PMSG/hCG诱导后的卵巢颗粒细胞中存在孕酮受体两个亚型的表达。（7）利用基因组PCR步移方法获得猪ADAMTS1基因转录起始位点上游1458bp的启动子序列。对猪ADAMTS1基因的启动子区序列进行了生物信息学分析,发现两个孕酮受体结合位点。通过以上预测结果,以1458bp的启动子序列为模板,以PCR方法获得4个5’侧翼缺失片断和3个定点突变孕酮受体结合位点的片断。将这些片断插入到载体pEGFP-1的报告基因EGFP的上游,构建相应的报告基因表达载体。将这些载体分别转染COS-7细胞,荧光显微镜观察和流式细胞仪分析启动子活性,发现在所构建的7个启动子片断之间没有显著的差异,这说明以上7个片断的启动子活性没有显著差异。（8）根据与人孕酮受体基因有较高同源性的猪EST以及人和小鼠孕酮受体cDNA相似性较高的区域设计引物,PCR扩增孕酮受体的DNA结合区域（DNAbinding domain,DBD）,构建表达载体pcDNA-PR DBD,并将其与以上构建的EGFP报告基因表达载体分别共转染COS-7细胞。荧光显微镜观察和流式细胞仪分析启动子活性,发现拥有孕酮受体结合位点的启动子片断的启动子活性显著高于没有或是突变此位点的启动子片断。利用EMSA检测ADAMTS1基因启动子上两个PR结合位点与PR的结合能力。EMSA试验在PMSG/hCG处理后卵巢颗粒细胞中的核蛋白中分别检测到了ADAMTS1基因启动子上两个PR结合位点与PR的特异性结合。以上结果说明:在ADAMTS1基因的启动子上存在孕酮受体结合位点,并且当孕酮受体通过其DBD区域结合在这些位点上时会增强ADAMTS1基因启动子的活性,启动ADAMTS1基因的表达。

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摘要

ABSTRACT

主要性状的中英文对照和英文缩写

第一章文献综述

1 前言

2 排卵过程研究进展

2.1 排卵过程的生物化学机制

2.2 排卵过程的分子机制

2.2.1 COC扩张

2.2.2 孕酮受体

3 ADAMTS1研究进展

3.1 ADAMTS1基因概况

3.2 ADAMTS1的结构

3.3 ADAMTS1基因的时空分布

3.3.1 ADAMTS1基因的表达谱

3.3.2 ADAMTS1基因被一些与炎症相关的因子所诱导

3.3.3 ADAMTS1基因在排卵前期瞬时表达

3.4 ADAMTS1基因的功能

3.4.1 ADAMTS1的敲除

3.4.2 PR基因与ADAMTS1基因的关系

3.4.3 ADAMTS1的其他功能

4 基因定位研究进展

5 启动子研究进展

5.1 启动子的特点

5.2 启动子克隆方法

5.3 生物信息学在启动子预测和分离中的应用

5.4 启动子结构和功能的研究方法

6 定点突变原理与方法研究进展

7 电泳迁移率检测技术研究进展

第二章猪ADAMTS1基因的分离、定位和遗传效应的研究

1 引言

2 试验材料

2.1 DNA样品

2.2 基因定位所用的猪辐射杂种克隆板（IMpRH）

2.3 主要仪器和设备

2.4 主要试剂及溶液

2.4.1 主要试剂

2.4.2 主要溶液

2.5 主要生物学软件

3 试验方法

3.1 基因组DNA的提取

3.1.1 猪基因组DNA的提取

3.1.2 基因组DNA浓度的测定和质量检测

3.2 扩增猪ADAMTS1基因所用引物的设计与合成

3.3 基因组扩增

3.4 PCR产物回收、克隆、测序和生物信息学分析

3.4.1 PCR产物的回收

3.4.2 载体连接

2法）'>3.4.3 感受态细胞的制备（CaCl₂法）

3.4.4 连接产物的转化

3.4.5 阳性克隆子鉴定及测序

3.5 猪ADAMTS1基因染色体精细定位

3.5.1 PCR扩增分型

3.5.2 数据分析

3.6 猪ADAMTSl蛋白质基本特征预测

4 结果与分析

4.1 猪ADAMTS1基因的克隆

4.2 猪ADAMTS1基因结构分析

4.3 猪ADAMTS1基因的染色体精细定位

4.4 猪ADAMTS1基因遗传效应分析

4.4.1 猪ADAMTS1基因第7外显子PvuⅡ酶切位点遗传效应分析

4.4.2 猪ADAMTS1基因第7内含子StyⅠ酶切位点遗传效应分析

5 讨论

5.1 基于EST序列分离新基因的策略

5.2 猪ADAMTS1基因组结构的分析

5.3 猪ADAMTS1基因预测的蛋白结构域、功能位点的分析

5.4 猪ADAMTS1基因的定位

5.5 猪ADAMTS1基因的SNP研究

5.6 猪ADAMTS1的遗传效应分析

第三章猪ADAMTS1基因表达模式的研究

1 引言

2 试验材料

2.1 试验样品

2.1.1 猪组织样品

2.2 主要仪器

2.3 主要药品及试剂

2.3.1 主要试剂

2.3.2 主要溶液

3 试验方法

3.1 试验组动物个体药物处理

3.2 卵巢颗粒细胞的分离、培养

3.3 猪组织和细胞样品RNA的提取和cDNA第一链的合成

3.3.1 猪组织/细胞总RNA的提取

3.3.2 RNA完整性的检测

3.3.3 猪组织总RNA的RNase-free DNase-Ⅰ处理及纯化

3.3.4 cDNA第一链的合成

3.4 RT-PCR方法扩增cDNA

3.4.1 PCR反应体系

3.4.2 RT-PCR反应产物的检测

4 结果与分析

4.1 猪卵巢颗粒细胞的分离与培养

4.2 猪组织/细胞总RNA的提取

4.3 猪ADAMTS1转录水平组织表达谱

4.4 猪ADAMTS1在猪卵巢颗粒细胞转录水平表达情况

4.5 猪PR基因在猪卵巢颗粒细胞转录水平表达情况

5 讨论

5.1 猪卵巢颗粒细胞的原代培养

5.2 猪ADAMTS1基因在器官水平的表达模式

5.3 猪ADAMTS1在猪卵巢颗粒细胞转录水平表达情况

5.4 猪ADAMTS1基因和PR基因在猪卵巢颗粒细胞转录水平表达的联系

第四章猪ADAMTS1基因启动子的研究

1 引言

2 试验材料

2.1 试验动物

2.2 质粒、菌株和细胞株

2.3 主要药品及试剂

2.4 常用试剂配方

2.5 引物

3 试验方法

3.1 基因组DNA的提取与纯化

3.2 基因组步移库的构建

3.2.1 基因组DNA的质量检测

3.2.2 基因组DNA的消化

3.2.3 DNA的纯化

3.2.4 连接接头

3.3 基因组PCR步移

3.4 步移产物的回收和克隆

3.5 外源DNA片段与质粒载体的连接反应

3.6 定点突变片段的获得

3.7 质粒的小量制备（碱裂解法）

3.8 质粒的大量制备（碱裂解法）

3.9 质粒DNA的定量

3.10 重组质粒（阳性质粒）的鉴定

3.11 细胞培养及传代

3.12 细胞株的保藏

3.13 冻存细胞的复苏

3.14 脂质体转染法

3.15 Western blot检测PR在卵巢颗粒细胞中的表达

3.16 EMSA探针的生物素标记

3.17 化学发光法EMSA

4 结果

4.1 猪ADAMTS1基因启动子的克隆及生物信息学分析

4.1.1 基因组步移库的构建

4.1.2 猪ADAMTS1基因启动子的获得

4.1.3 生物信息学预测ADAMTS1启动子上转录因子结合位点

4.1.4 猪ADAMTS1启动子功能分析

4.2 猪孕酮受体基因DBD区域的克隆和表达质粒的构建

4.3 猪PR与ADAMTS1的相互作用分析

4.4 孕酮受体在卵巢颗粒细胞中的Western blot杂交鉴定

4.5 EMSA结果

5 讨论

5.1 ADAMTS1启动子的研究策略

5.1.1 猪ADAMTS1基因启动子的克隆

5.1.2 猪ADAMTS1基因启动子的生物信息学分析

5.1.3 报告基因系统和转染系统

5.2 猪ADAMTS1基因启动子结构和功能的分析

5.3 EMSA技术在本研究中的运用

5.4 ADAMTS1基因启动子上的其他元件

下一步的工作

小结

主要创新点

主要参考文献

致谢

在读期间发表论文题录

附录:所获得猪ADAMTS1基因DNA序列

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