H3N2亚型猪流感病毒生物学特性和HA、NA、NS基因特性的研究

论文摘要

本实验对2004年广东省部分地区出现呼吸道症状的猪群或病死猪的鼻拭子和病变肺脏进行了猪流感病毒（SIV）的分离鉴定。所采病料匀浆灭菌,接种SPF鸡胚扩增培养并且传代,收获鸡胚尿囊液。利用猪流感标准诊断试剂,用血凝和血凝抑制试验检测病毒并且鉴定分离毒株病毒亚型为H3亚型SIV。对所分离到的6株H3亚型SIV分离株进行了生物学特性测定,分离毒株红细胞凝集谱广泛,血凝素对热不稳定,对鸡胚表现较高的致病性,能够感染小白鼠并表现典型的呼吸道症状和眼观病变。应用Primer Premier 5.0引物设计分析软件设计H3N2亚型SIV HA、NA、NS、NS1基因片段的特异性PCR引物。分别从6株H3亚型SIV分离株感染的SPF鸡胚尿囊液中直接提取核酸。通过反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法扩增各个毒株的HA、NA、NS基因片段,PCR产物经分离纯化后克隆到pMD 18-T载体中,重组质粒经PCR鉴定纯化后再送测序公司进行序列测定,然后应用DNAStar软件进行序列的拼接、序列信息编辑和分析。同时从GenBank中下载了H3N2亚型猪流感各时间和地域的代表株,分析6个毒株3个基因片段的核苷酸和氨基酸的序列,以阐明广东地区H3N2亚型SIV分离株的基因来源和遗传衍化规律。结果6个病毒同源性很高,在HA裂解位点处的氨基酸序列均为PEKQTR*G,不属于高致病性流感病毒。它们的3个基因与1999年以后香港猪群中流行的流感和2000年以后北美流行的H3N2亚型流感毒株关系密切。根据序列分析结果选择其中一个SIV分离株进行非结构蛋白基因的重组质粒pMD18 T-NS中的NS1基因片段的亚克隆。再将其插入表达载体pET 28a中进行基因重组和大肠杆菌诱导表达。构建出了H3亚型SIV NS1基因的重组表达载体,初步建立了NS1基因在大肠杆菌的表达条件。为NS1基因蛋白的大量诱导表达及其下游工作做好了准备。总之,本研究系统地阐明了目前广东地区H3N2亚型SIV分离株的生物学特性、基因来源、分子遗传衍化情况和NS1基因的表达条件,为今后H3N2亚型SIV的进一步研究以及猪流感的诊断和防制奠定了基础,为中国乃至全球（人）流感疫情发生的可能性和发展趋势的研究提供一定的理论依据。本研究无论是在病毒学,还是在兽医学等学科上都有重要的学术意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 猪流感概况
• 1.1.1 猪流感的流行及历史
• 1.1.2 病原学
• 1.1.3 流行病学
• 1.2 猪流感病毒的生物学特性
• 1.2.1 血凝特性
• 1.2.2 抗原性
• 1.2.3 增殖特性
• 1.3 猪流感病毒的基因组特性
• 1.4 病毒蛋白
• 1.4.1 血凝素（HA）
• 1.4.2 神经氨酸酶（NA）
• 1.4.3 核蛋白（NP）
• 1.4.4 基脂蛋白（M）
• 1.4.5 聚合酶蛋白（PA、PB1 和PB2）
• 1.4.6 非结构蛋白（NS1 和NS2）
• 1.5 猪流感病毒的种间传播
• 1.5.1 SIV 种间传播的分子机理
• 1.5.2 SIV 的种间传播和流感的发生流行
• 1.6 猪流感病毒的分子进化
• 1.7 猪流感的诊断
• 1.7.1 诊断样品
• 1.7.2 诊断方法
• 1.8 公共卫生意义
• 2 实验部分
• 2.1 实验一猪流感病毒分离鉴定及生物学特性的研究
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.3 结果与分析
• 2.1.4 讨论
• 2.2 实验二猪流感病毒 HA、NA、NS 基因的克隆、测序及其分析
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.2.3 结果与分析
• 2.2.4 讨论
• 2.3 实验三猪流感病毒NS1 基因在大肠杆菌中的表达
• 2.3.1 材料
• 2.3.2 方法
• 2.3.3 结果与分析
• 2.3.4 讨论
• 3 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录 H3N2 亚型SIV HA、NA、NS 基因序列
• 附录 A H3N2 亚型 SIV HA 基因序列
• 附录 B H3N2 亚型 SIV NA 基因序列
• 附录 C H3N2 亚型 SIV NS 基因序列
• 作者简介