金黄色葡萄球菌肠毒素C2突变体构建及其生物活性研究

论文摘要

金黄色葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxins, SEs）是一类具有高度生物学活性的蛋白质、能活化T细胞的超抗原。与普通抗原不同,超抗原无须经抗原提呈细胞（Antigen presenting cell, APC）加工处理,可以完整的蛋白分子形式直接与抗原提呈细胞膜上的MHC-II（Major histocompatibility complex class II molecules, MHC-II）类分子及T细胞受体Vβ区（Variable pacts of the T cells receptor, TCR V?）特异性结合,刺激T细胞增殖,产生大量有生物学活性的细胞因子和药性效应,引发超级抗原依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Superantigen dependent cell-mediated cytotoxicity, SDCC）和其它免疫效应。利用SEs的这一特点,沈阳协和集团开发出以金黄色葡萄球菌肠毒素C2（SEC2）为主要成分的新型抗肿瘤生物制剂——“高聚生”,临床用于治疗肺癌、食道癌、卵巢癌、晚期肝癌、大肠癌、血癌、膀胱癌等恶性肿瘤,效果显著。但作为潜在的肠胃毒素,SEC2可引起食物中毒,引发腹绞痛和严重腹泻,这严重影响和限制了其在临床的广泛应用。肠毒素结构与其致病性及致病能力关系密切,肠毒素所引发的催吐效应和T细胞诱导效应无关,而与胱氨酸环（Cys93, Cys110）及His118有关。为此,本研究利用基因定点突变技术,选择性替换SEC2中110位Cys和118位His,获得了相应的突变基因,并在大肠杆菌中实现高效表达。体外PBMC（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC）增殖和抑瘤实验被用于分析突变体蛋白的超抗原活性和抑瘤活性。本研究结果如下:1)利用PCR定点突变技术,SEC2中110位Cys成功的被Ala和Ser替换,118位的His被Tyr替换。带有突变基因的表达质粒在E. coli BL21 （DE3）中经IPTG诱导,实现高效表达。SDS-PAGE电泳结果表明,经Ni-NTA亲和层析柱和Sephadex G-75纯化获得的突变体蛋白呈单一条带;2) PBMC增殖研究表明,所有突变体蛋白均能有效刺激PBMC增殖,与SEC2无明显差异,在200 ng/ml时,增殖能力最强。3)体外抑瘤实验表明,所有突变体都在不同程度上抑制了大肠癌细胞CX-1的生长,其中SEC2（C93S, C110S）抑瘤效果最为明显,在2 ng/ml和500 ng/ml之间,抑瘤效果均略高于SEC2。综上所述,本研究成功的利用基因定点突变技术,替换了SEC2中与催吐有关的氨基酸,获得了超抗原活性和抑瘤活性基本保持不变的SEC2突变体,从而为开发无毒、无副作用的新型抗肿瘤生物制剂奠定了工作基础。

论文目录

• 内容摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 超抗原
• 1.2 金黄色葡萄球菌肠毒素超抗原
• 1.3 金黄色葡萄球菌肠毒素C2 及其应用
• 1.4 目的和意义
• 第二章 金黄色葡萄球菌肠毒素C2 定点突变研究
• 2.1 实验目的
• 2.2 方案设计与分析
• 2.3 实验材料与试剂
• 2.4 实验操作方法
• 2.5 实验结果与讨论
• 2.6 小结
• 第三章 肠毒素突变体蛋白生物活性研究
• 3.1 实验目的
• 3.2 方案设计与分析
• 3.3 实验材料与试剂
• 3.4 实验方法
• 3.5 实验结果与讨论
• 3.6 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文以及参加科研情况