大肠杆菌O157喹诺酮类耐药相关机制的研究

论文摘要

大肠杆菌0157:H7是医学和兽医学临床感染中常见的病原菌之一,建立快速检测方法对食品安全和人类健康具有重要意义。大肠杆菌0157对多种抗菌药物耐药主要与菌体中存在的外输泵有关。一般认为AcrAB-To1C外输泵是最主要的外输泵,能够输出多种抗菌药物、化疗试剂、洗涤剂和染料类。如果使该系统失活,大肠杆菌0157可从多重耐药状态变为相对敏感状态。本实验通过建立大肠杆菌0157:H7的快速检测方法,研究大肠杆菌0157:H7对氟喹诺酮类药物的基因突变耐药机制,检测临床分离的动物源性大肠杆菌0157的acrA、acrB基因的mRNA和蛋白的表达水平,寻找acrA、acrB基因的表达水平与大肠杆菌0157多重耐药水平的相关性。研究快速、特异、灵敏的检测肠出血性大肠杆菌0157:H7的多重PCR、荧光定量PCR方法并比较单一PCR和多重PCR、荧光定量PCR对检测灵敏度的影响。选择0157:H7的O抗原、H鞭毛抗原及SLT1和SLT2毒素基因特异的4对引物,分别或共同进行PCR扩增,检测24株0157:H7和非0157:H7菌株,将细菌稀释后比较PCR的检测灵敏度。同时设计TaqMan荧光探针进行荧光定量PCR进行灵敏度检测。所有0157:H7菌株均在497bp和625bp处出现0157抗原基因和H7抗原基因产物,其产毒株在484bp和（或）210bp处出现SLT1和（或）SLT2基因产物,非0157:H7菌株PCR结果均为阴性;单一PCR检测,灵敏度为150CFU/PCR反应,多重PCR为>1500CFU/PCR反应,而荧光定量PCR为14CFU/PCR反应。选用临床分离的4株耐药菌、实验室诱导培养获得的3株耐药菌和1株敏感菌,提取其染色体DNA,PCR扩增gyrA和parC基因片段,并将其克隆和测序。结果表明,无论是临床分离的还是实验室诱导的耐药菌,gyrA基因在其编码第83位或第87位氨基酸处均发生突变,parC基因在其编码第80位或第84位氨基酸处发生突变,而敏感菌ES在2个基因位点上均未发生突变。其中2株低度耐药菌株的gyrA基因出现单一突变,使其编码的氨基酸发生改变,分别为Ser83-Leu或Asp87-Asn,但在parC基因上却未发生突变;其余5株高度耐药菌gyrA基因突变导致氨基酸发生改变:Ser83-Leu,Asp87-Asn和Tyr,其中两株parC基因突变导致氨基酸改变:Ser80-Ile和GIu84-Lys。这2个基因的突变均与文献报道的突变相同,表明gyrA基因Ser83和Asp87突变以及parC基因Ser80和G1u84突变可能与大肠杆菌0157的氟喹诺酮类药耐药机制有关,且低度耐药只在gyrA基因上出现单一位点突变,当高度耐药时,才同时在parC基因上出现突变,gyrA , parC是大肠杆菌0157:H7耐氟喹诺酮类药物的基因标识。多重耐药大肠杆菌0157acrA、acrB基因的mRNA的水平比较,将耐药株的反转录产物量相当的内参稀释度与大肠杆菌0157 EDL933的反转录产物量相当的内参稀释度做比较的结果表明:高水平耐药与EDL933菌株的acrA、acrB的mRNA水平相比较提高4-8倍;中度耐药的大肠杆菌0157的acrA、acrB的mRNA水平与EDL933的acrA、acrB的mRNA水平相比提高1-2倍,低水平耐药与EDL933的acrA、acrB的mRNA水平相当。与EDL933的acrA、acrB基因的mRNA的水平相比,同一菌株的acrA、acrB基因的mRNA的水平基本一致,可能是由于二者由一个操纵子调控的原因。acrA、acrB是大肠杆菌0157:H7多重耐药的基因标识,其mRNA转录水平与大肠杆菌0157:H7的多重耐药水平呈正相关性。本研究结果表明,多重PCR和荧光定量PCR可对大肠杆菌0157:H7进行定性定量检测:大肠杆菌0157:H7gyrA基因、Ser83和Asp87突变以及parC基因Ser80和G1u84突变可能与大肠杆菌0157的喹诺酮类药耐药机制有关,且低度耐药只在gyrA基因上出现单一位点突变;当高度耐药时,才同时在parC基因上出现突变。大肠杆菌0157:H7同一菌株的acrA与acrB基因的mRNA的水平是基本一致的:与敏感株相比,acrA的mRNA水平与其蛋白表达水平基本一致;多重耐药大肠杆菌O157的mRNA和蛋白表达水平与其耐药水平有一定的相关性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 综述部分
• 第一章：大肠杆菌耐药性分子机制的研究进展
• 第二章：喹诺酮类药物耐药性的分子机制
• 研究部分
• 第三章:荧光定量 PCR 检测 O157:H7 型大肠杆菌方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要实验仪器
• 1.1.3 菌株及血清
• 1.1.4 引物的设计与合成
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌落计数单位的测定
• 1.2.2 染色体DNA 提取
• 1.2.3 临床分离株的分离及血清型检测
• 1.2.4 普通PCR 鉴定临床分离大肠杆菌
• 1.2.5 荧光定量标准曲线制定
• 1.2.6 荧光定量敏感性及特异性检测
• 2 结果
• 2.1 CFU 和染色体 DNA 测定结果
• 2.2 动物源致病性大肠杆菌临床分离株的检测结果
• 2.3 标准曲线制备
• 3 讨论
• 第四章 临床分离多重耐药大肠杆菌O157acrA、acrB 基因mRNA 水平的定量测定
• 1 材料
• 1.1 菌株及克隆载体
• 1.2 引物的设计与合成
• 1.3 酶与试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 AcrA、AcrB 基因的获取
• 2.1.1 大肠杆菌染色体DNA 的提取
• 2.1.2 acrA、acrB 基因目的片段的PCR 扩增
• 2.1.3 DNA 琼脂糖凝胶电泳
• 2.1.4 PCR 产物的回收
• 2.2 acrA、acrB 基因片段的克隆
• 2.2.1 目的基因片段与载体的连接
• 2.2.2 JM109 感受态菌的制备
• 2.2.3 重组质粒的转化
• 2.2.4 阳性克隆的筛选
• 2.2.5 重组质粒的鉴定
• 2.3 内参的合成
• 2.4 mRNA 的检测
• 2.4.1 总RNA 的提取
• 2.4.2 菌体总RNA 的反转录
• 2.4.3 PCR 扩增反转录产物
• 2.4.4 对15 株大肠杆菌的acrA、acrB 的mRNA 水平定量
• 3 结果
• 3.1 大肠杆菌ATCC25922 基因组的提取
• 3.2 大肠杆菌ATCC25922 acrA、acrB 基因片段的PCR 扩增
• 3.3 PCR 产物的克隆及阳性克隆的筛选
• 3.4 克隆质粒的序列分析
• 3.4.1 acrA 基因序列测序
• 3.4.2 acrB 基因序列测序
• 3.5 acrA、acrB 内参的合成
• 3.6 对15 株大肠杆菌的acrA、acrB 的mRNA 水平进行定量
• 3.6.1 菌体总RNA 的提取
• 3.6.2 RT-PCR
• 3.6.3 对15 株大肠杆菌的acrA、acrB 的mRNA 水平进行定量
• 3.7 多重耐药株acrA、acrB 的mRNA 相对水平与大肠杆菌ATCC25922 的比较
• 4 讨论
• 4.1 定量RT-PCR 内标准的建立
• 4.2 反转录的引物的选择
• 4.3 acrA、acrB 的mRNA 表达水平与大肠杆菌对喹诺酮类药物耐药水平的相关性
• 4.4 acrA、acrB 的mRNA 的相对表达水平的一致性
• 第五章 大肠杆菌氟喹诺酮类药物耐药机制的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 抗菌药物敏感试验结果
• 2.2 PCR 结果
• 2.3 重组质粒双酶切电泳结果
• 2.4 基因突变结果
• 3 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介