φC31整合酶介导溶葡萄球菌素基因在新生牛耳成纤维细胞中的定点整合

论文摘要

奶牛乳腺炎是一种严重影响奶牛健康和生产性能以及乳品质量的常见疾病，对该疾病的预防和治疗一直是奶牛饲养中解决的关键问题，也是一个长期以来，不能有效解决的难题。抗乳腺炎转基因牛新品种的培育，为解决这一问题带来了新的希望和思路。本研究中，以重组溶葡萄球菌素为目的基因，利用фC31整合酶将该基因插入奶牛基因组中，经过细胞转染与筛选鉴定，得到阳性转基因细胞，最终为抗乳腺炎转基因牛的生产提供可以用于核移植的供体细胞。通过实验得到了以下研究结果：（1）乳腺特异性载体pEGFP-C1MAB的构建本研究以pEGFP-C1载体为骨架，将两个同向的loxP位点、酪蛋白启动子、溶葡萄球菌素等元件插入载体中。其中，在新霉素抗性基因的两端插入方向相同的loxP位点。载体中还插入了672bp的两个鸡β球蛋白绝缘子元件。（2）新生牛耳成纤维细胞的转染及筛选本研究通过组织块培养法分离新生牛耳成纤维细胞，Fugene HP转染后，经过600μg/mL的G418筛选，得到生物学特征正常的阳性细胞株，细胞周期和细胞核型分析证明细胞染色体正常，经过多重PCR和Southern blotting鉴定,溶葡萄球菌素基因成功整合到基因组中。（3）重组溶葡萄球菌素在乳腺上皮细胞中的表达本研究通过组织块培养法和差速分离纯化法得到正常的乳腺上皮细胞，转染乳腺上皮细胞后，经过300μg/mL的G418筛选得到阳性克隆细胞，EGFP基因正常表达。诱导后经Western blotting验证，可以检测到重组溶葡萄球菌素基因的正常表达。以上结果表明，本研究所构建的载体，通过转染乳腺上皮细胞和阳性细胞株验证，溶葡萄球菌素基因能够正常表达，并以单拷贝在基因组中得到整合。该研究为生产抗乳腺炎转基因牛提供可以用于核移植的供体细胞，为抗乳腺炎转基因牛新品种培育奠定了一定的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 转基因家畜概况
• 1.1 经典转基因策略
• 1.1.1 显微注射技术
• 1.1.2 体细胞核移植技术
• 1.2 新兴的转基因策略
• 1.2.1 慢病毒载体介导的转基因技术
• 1.2.2 条件性表达的转基因技术
• 1.2.3 多能性细胞介导的转基因技术
• 1.2.4 RNA 介导的基因干扰技术
• 1.2.5 转座子系统介导的转基因技术
• 1.2.6 位点特异性整合酶介导的基因整合
• 1.2.7 基因打靶介导的转基因技术
• 1.2.8 锌指核酸酶介导的打靶技术
• 1.3 转基因家畜的应用
• 1.3.1 转基因家畜在生物医学和基础医学中的应用
• 1.3.2 转基因家畜在农业生产中的应用
• 第二章 溶葡萄球菌素基因概述
• 2.1 溶葡萄球菌素的理化特性
• 2.2 溶葡萄球菌素的酶学特性
• 2.3 溶葡萄球菌素的抗菌功能
• 2.4 溶葡萄球菌素的克隆表达研究
• 2.5 溶葡萄球菌素的应用
• 2.5.1 溶葡萄球菌素在医学治疗上的应用
• 2.5.2 溶葡萄球菌素在其他方面的应用
• 2.6 小结
• 实验部分
• 第三章 乳腺特异性表达载体 pEGFP-C1MAB 的构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 目的基因的 T-A 克隆
• 3.2.2 β-酪蛋白 5′端与 3′端扩增及 pCSN53lys 载体构建与鉴定
• 3.2.3 attB 位点和鸡β球蛋白绝缘子的克隆及 pattBInsulor12 载体构建与鉴定
• 3.2.4 loxP 位点的添加及 pEGFP-C1M 载体的构建与鉴定
• 3.2.5 乳腺特异表达载体 pEGFP-C1MAB 的构建与鉴定
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 转溶葡萄球菌素基因细胞的制备与鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 乳腺特异性表达载体 pEGFP-C1MAB 的纯化
• 4.2.2 牛耳成纤维细胞的转染、单克隆细胞的筛选及鉴定
• 4.2.3 阳性细胞的多重 PCR 鉴定
• 4.2.4 阳性细胞的 Southern blotting 鉴定
• 4.2.5 阳性细胞的核型分析
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 重组溶葡萄球菌素在牛乳腺上皮细胞的表达
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 pEGFP-C1MAB 载体的纯化
• 5.2.2 乳腺上皮细胞的分离与纯化
• 5.2.3 乳腺上皮细胞的转染及绿色荧光蛋白的表达
• 5.2.4 溶葡萄球菌素在乳腺上皮细胞中的表达
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 论文总结论
• 参考文献
• 附录一 载体构建过程
• 附录二 主要仪器
• 附录三 主要试剂
• 附录四 主要试剂配制
• 致谢
• 个人简介