论文摘要
PCR技术已被应用到生命科学的各信息领域,因其敏感性高、特异性强、操作简便、所需时间短等优点,目前已被广泛用于病原微生物的检测。PCR检测技术的第一步就是模板DNA的制备,即样本中DNA的提取,这直接影响着PCR反应的结果。长期以来,样本中DNA的提取和纯化一直是耗时、繁琐的过程,大大减慢了检测速度。而且传统的酚-氯仿抽提法使用大量有机溶剂,对环境和操作人员造成危害。因此,许多学者一直在探索各种DNA的提取方法,近年来常见的是以二氧化硅作固相吸附剂提取DNA,如玻璃奶法,硅胶树脂型离心柱法等。这类方法是利用二氧化硅在高离子强度、低pH值条件下吸附DNA,用洗涤液洗掉吸附在二氧化硅表面的其它杂质,再用低离子强度、高pH值缓冲液洗脱吸附在二氧化硅表面的DNA分子,用于分子生物学实验。这些方法避免使用酚-氯仿抽提,但需用乙醇沉淀,并涉及蛋白酶处理,步骤也比较烦琐。1997年英国科学家研究了抗-DNA单克隆抗体与免疫磁珠结合的方法提取DNA,收到较好的效果。 为了提高PCR技术在检测现场环境标本中的敏感性和实用性,我们研制了抗-DNA单克隆抗体,通过标记胶体金制备成免疫胶体金试剂,期望通过建立免疫胶体金提取纯化环境标本中细菌DNA技术,完善现场标本PCR检测实验,满足防生反恐斗争的需要。将抗-DNA单克隆抗体标记在胶体金颗粒上制成免疫胶体金试剂,提取标本中DNA,直接用于PCR检测。结果表明:应用免疫胶体金试剂可有效去除环境标本中PCR抑制剂,浓缩模板,提高PCR检测敏感度3-4个数量级。在分别对类鼻疽菌系列稀释菌液和土壤、牛奶等模拟标本的检测中,免疫胶体金法最低检测浓度分别为100菌/mL、101菌/mL、100菌/mL。整个操作步骤简单,无需使用有机溶剂,避免环境污染,吸附了DNA的免疫胶体金可直接用于PCR扩增。结论,研制了抗DNA单抗标记的免疫胶体金试剂并确
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